Substrat

Substrat menjadi hal yang penting di banyak bidang ilmu hayati, baik sebagai perangkat maupun target dalam sistem deteksi. Di bidang biokimia, substrat adalah suatu molekul yang menjadi sasaran aksi enzim. Enzim mengkatalisis reaksi kimia yang melibatkan substrat. Dalam hal substrat tunggal, substrat berikatan dengan situs aktif enzim, dan terbentuk kompleks enzim-substrat. Peran substrat untuk mendeteksi suatu enzim dapat diaplikasikan pada pengujian ELISA, Blotting, enzyme assays, IHC dan banyak lagi.

Baca juga artikel mengenai 2 jenis inhibisi enzim di sini

Sebuah substrat dapat disebut ‘kromogenik’ jika ia menghasilkan produk berwarna ketika diberi aksi oleh enzim. Misalnya saja Nitroblue Tetrazolium (NBT) digunakan dengan substrat alkaline phosphatase yaitu 5-Bromo4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (BCIP) dapat memunculkan warna pada proses Western Blot dan imunohistokimia (IHC). Substrat tersebut menghasilkan senyawa NBT diformazan yang tidak larut dalam air berwarna biru sampai keunguan dan dapat diamati secara visual. Tahap pewarnaan pada aplikasi imunohistokimia dapat menggunakan pewarna Nuclear Fast Red atau Light Green, namun umumnya penggunaan BCIP/NBT akan lebih sensitif.

Gambar 1. Reaksi Enzim-Substrat (BCIP-NBT) menghasilkan warna biru/ungu (NBT Diformazan)

Adapun Substrat pNPP dapat membentuk warna kuning (p-nitrophenol) ketika dihidrolisis oleh  alkaline phosphatase. P-nitrophenol merupakan senyawa yang larut dalam air sehingga cocok untuk ELISA, namun tidak direkomendasikan untuk aplikasi western blot dan IHC. Warna kuning yang dihasilkan dapat terbaca pada panjang gelombang 405 nm. Dan reaksi ini dapat dihentikan dengan penambahan larutan Sodium hidroksida (NaOH) 3M. Biasanya pada aplikasi ELISA, substrat dimasukan sebanyak 200 uL ke dalam well plate lalu ditambahkan 50 uL NaOH 3M untuk menghentikan reaksinya. Saat ini tersedia enzim-substrat dalam bentuk kit, cair, serbuk dan tablet. Jenis-jenis substrat pun beraneka ragam dan berbeda untuk setiap aplikasi.

Sumber : Sigma-Aldrich. BioFiles Volume 3, Number 4. Substrate Systems for Enzyme Detection.