Pendahuluan

Diagnosis dini dan akurat terhadap suatu penyakit memegang peranan penting dalam penanganannya yang efektif, terutama dalam keadaan darurat. Contohnya seperti dimana keputusan perlu segera diambil bagi pasien yang dirawat dan identifikasi kondisi patologis yang cepat dan tepat sangat penting. Namun, dalam banyak kasus, bukti klinis berdasarkan satu analit atau biomarker saja tidak memadai untuk diagnosis penyakit yang tepat atau pemantauan pengobatannya. Penanda biologis atau biomarker memiliki signifikansi patofisiologis dan aplikasi klinis yang dapat berdampak besar pada diagnosis dan pengobatan pasien.

Metode ELISA sudah populer di berbagai kalangan baik peneliti maupun profesional kesehatan yang dapat mendeteksi kadar biomarker dalam konsentrasi yang sangat rendah. ELISA atau Enzyme-Linked Immunosorbent Assay adalah metode pengujian di laboratorium yang lebih sensitif dan spesifik dibandingkan dengan rapid test. Metode pengujian ELISA tergolong dalam teknik singleplex kontemporer yang mampu menganalisis analit tunggal secara akurat. Immunoassay ELISA singleplex atau konvensional telah berperan penting dalam deteksi kualitatif dan kuantitatif analit yang sangat sensitif dalam sampel heterogen selama lebih dari setengah abad. Meski demikian, ELISA merupakan metode yang memakan waktu dan reagen, dan teknik dengan biaya yang lebih rendah serta mendeteksi beberapa target pada saat yang sama lebih disukai, karena kemungkinan adanya beberapa polutan secara bersamaan.

Baru-baru ini, beberapa uji imuno multiplex telah dijelaskan, yang memungkinkan deteksi spesifik dan bersamaan dari beberapa target. Pemantauan yang lebih kompleks memerlukan analisis beberapa biomarker untuk menerapkan regimen terapi yang dioptimalkan. Analisis beberapa biomarker tersebut dikenal dengan ELISA multiplex.

Perkembangan arus globalisasi turut mendorong munculnya teknologi hibridoma sebagai sarana untuk menghasilkan antibodi monoklonal (MAb). Teknologi ini telah memfasilitasi pembuatan uji berbasis antibodi yang sangat kuat untuk standarisasi dan otomatisasi. Baik ELISA singleplex maupun multiplex mengadopsi format “sandwich” yang umum (antibodi penangkap-analit-antibodi pendeteksi). ELISA multiplex menggunakan sistem pelapor kemiluminesensi/fluoresensi. Hal ini karena pelapor enzimatik secara kimiawi tidak kompatibel untuk analisis simultan dari beberapa target biomarker yang terlokalisasi (Saxena dan Prakash, 2021).

Definisi Teknik Multiplexing ELISA

Multiplexing ELISA adalah teknik imunometri yang memungkinkan deteksi simultan beberapa analit dalam satu sampel menggunakan antibodi yang terkonjugasi pada manik-manik berfluoresensi. Setiap manik memiliki ukuran dan intensitas fluoresensi yang berbeda sehingga memungkinkan identifikasi dan kuantifikasi berbagai biomarker secara bersamaan. Teknik ini sering digunakan dalam penelitian untuk mengukur sitokin.

Gambar 1. Prinsip Multiplex ELISA (Elabscience)

Prinsip pengujian ini mirip dengan capture sandwich ELISA, kecuali bahwa antibodi penangkap dilapisi ke manik-manik (beads) dalam suspensi, daripada langsung dilapisi ke sumur. Beads dilapisi terlebih dahulu dengan antibodi monoklonal penangkap, khusus untuk satu sitokin, dan diberi label internal dengan kombinasi unik pewarna fluoresen. Dengan mencampur beads yang berbeda, hingga 100 analit yang berbeda dapat dideteksi secara bersamaan.

Beads khusus untuk sitokin yang diinginkan diinkubasi dengan sampel yang mengandung sitokin target dalam satu sumur dari 96 well-plate 96. Setelah dicuci untuk menghilangkan protein yang tidak terikat, antibodi deteksi biotinilasi (sekali lagi khusus untuk setiap sitokin yang diinginkan) ditambahkan. Streptavidin-Phycoerythrin (Strep-PE), yang mengikat antibodi deteksi biotinilasi, kemudian ditambahkan. Sumur tambahan dialokasikan untuk kontrol standar yang mengandung jumlah yang diketahui dari setiap sitokin (Min You dkk., 2007).

Berikut prinsip dasar dari multiplex ELISA secara lebih lengkap.

1. Imobilisasi Antigen atau Antibodi
   Pada multiplex ELISA, beberapa jenis antigen (atau antibodi) yang berbeda diimobilisasi pada permukaan mikrotiter plate yang memiliki beberapa sumur (wells). Setiap sumur dilapisi dengan antigen atau antibodi yang spesifik untuk biomarker atau analit yang ingin dideteksi. Dalam hal ini, beberapa jenis antigen atau antibodi dapat ditempatkan pada berbagai lokasi di permukaan sumur yang sama.

2. Penambahan Sampel
   Sampel yang mengandung berbagai biomarker atau analit ditambahkan ke dalam sumur-sumur tersebut. Jika target biomarker ada dalam sampel, ia akan berikatan dengan antigen atau antibodi yang ada di permukaan sumur.

3. Penambahan Deteksi Antibodi
   Setelah antigen atau antibodi target berikatan dengan biomarker, langkah selanjutnya adalah penambahan antibodi deteksi yang terkonjugasi dengan enzim (misalnya, horseradish peroxidase/HRP atau alkaline phosphatase/AP). Setiap antibodi deteksi spesifik untuk biomarker tertentu yang ada dalam sampel.

4. Penambahan Substrat
   Setelah ikatan antara antibodi deteksi dan biomarker terbentuk, substrat enzim ditambahkan. Substrat ini akan mengalami perubahan warna (biasanya perubahan warna atau fluoresensi) yang dapat diukur menggunakan pembaca mikroplate. Warna atau sinyal ini proporsional dengan jumlah biomarker yang ada dalam sampel.

5. Pembacaan dan Analisis Hasil
   Dengan menggunakan pembaca mikroplate, sinyal yang dihasilkan oleh setiap sumur (biasanya dalam bentuk absorbansi atau fluoresensi) diukur. Setiap biomarker yang diuji akan menghasilkan sinyal yang dapat dibedakan berdasarkan panjang gelombang tertentu (misalnya, jika menggunakan fluoresens, setiap biomarker dapat diberi label dengan pewarna fluoresen yang berbeda). Dengan demikian, multiplex ELISA memungkinkan analisis simultan dari berbagai biomarker dalam satu sampel.

6. Pengolahan Data
   Setelah pembacaan dilakukan, data analisis dari berbagai biomarker yang terdeteksi dibandingkan dengan kurva standar untuk menentukan konsentrasi masing-masing biomarker dalam sampel.

Produk EcoPlex Panel Inflamasi Elabscience

EcoPlex™ Panel Inflamasi adalah rangkaian kit deteksi multiplex berbasis Cytometric Bead Array (CBA) yang dirancang untuk mengukur beberapa sitokin dan kemokin dalam satu sampel secara simultan. Kit ini cocok untuk penelitian inflamasi, imunologi, dan biomarker penyakit. Kit ini menggunakan manik antibodi dengan ukuran dan intensitas fluoresensi yang berbeda untuk menangkap antigen dalam sampel. Setelah inkubasi, antibodi deteksi biotinilasi ditambahkan, diikuti dengan konjugasi streptavidin-R-Phycoerythrin (SA-PE). Intensitas fluoresensi diukur menggunakan flow cytometer untuk kuantifikasi analit.

Teknologi deteksi multifaktor yang digunakan adalah metode analisis imunologi berbasis mikrosfer. Prinsipnya mirip dengan metode ELISA “Sandwich“. Teknologi ini menggunakan manik-manik berlapis antibodi untuk menangkap antigen, diikuti oleh inkubasi koktail antibodi terbiotinilasi untuk membentuk kompleks “sandwich”. Intensitas fluoresensi PE pada setiap populasi manik diukur dengan Flow Cytometer.

Kit ini dapat diterapkan dalam studi biologi, seperti regulasi imun, respons inflamasi, dan metastasis tumor. Dibandingkan dengan Kit ELISA Tradisional, kit ini memberikan sensitivitas deteksi yang lebih tinggi dan jangkauan deteksi yang lebih luas, dan dapat digunakan untuk analisis sitokin tertentu dalam supernatan kultur sel, plasma EDTA, dan sampel serum. Adapun keuntungan dari kit multiplex brand Elabscience adalah sebagai berikut.

1. Sampel lebih sedikit, hanya perlu 15 – 45 μL
2. Eksperimen lengkap memakan waktu 3 jam
3. Jangkauan deteksi luas dan sensitivitas tinggi
4. Beberapa protein dapat ditentukan secara bersamaan

Berikut adalah produk EcoPlex Panel Inflamasi dari brand Elabscience.

Untuk pertanyaan produk dan stock lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kami PT. Indogen melalui email sales.indogen@gmail.com atau melalui WhatsApp berikut untuk fast respon WhatsApp Indogen.

Referensi :

1. Garland, R. (n.d.). Multiplex analysis of cytokines. British Society for Immunology.
2. Saxena, S., & Prakash, H. (Eds.). (2021). Innate Immunity in Health and Disease, Chapter 15. IntechOpen. doi: 10.5772/intechopen.82921
3. Min You, Jing-Yi Lo, Yanqiu Wang, Xiang Yu. (2007). Profiling Cytokine Levels Using a Multiplex Human Cytokine ELISA Array (94.26). J Immunol; 178.

Artikel Terkait

1. https://indogen.id/ecoplex-multiplex-assay/
2. https://indogen.id/elisa-kit/
3. https://indogen.id/seleksi-antibody-pair-set-elabscience-dalam-developmental-elisa-pada-riset-inflamasi/
4. https://indogen.id/metode-dan-marker-rapid-test-dan-elisa-untuk-sample-industri-perikanan-di-indonesia/
5. https://indogen.id/prinsip-isolasi-sel-metode-macs-dengan-kit-elabscience/