Pusat Akademik, Inovasi, Teknologi, dan Riset Kesehatan Universitas Padjadjaran mengadakan Webinar dan Workshop setiap tahunnya yang diketuai oleh Prof. Nur Atik, dr., M.Kes., MOHRE., PhD. Kegiatan ini bertujuan dalam upaya sharing knowledge dan diskusi bersama peneliti kedokteran agar memiliki pemahaman terkait metode Immunological Assay yang digunakan dalam penelitian bidang kedokteran. Oleh karena itu, kegiatan ini setiap tahunnya diadakan agar dapat membantu peneliti dalam melakukan eksperimen dan riset di laboratorium sesuai dengan objektif penelitian dan metode yang dipilih. Sebelum hands on dilakukan, terdapat webinar yang diadakan secara gratis mengenai 4 topik menarik antaranya; Immunity: The Equilibrium between Disease and Stress Response, Recent Update in Immunology of Skin Disorders and Their Potential for Basic Research, The Role of Immunology in Autoimmune Disease: Pathways for Basic Research Opportunity, dan Alternative Immunology Laboratory Methods in Resource-Limited Settings. Pada keesokan harinya diadakan acara Workshop on Basic Immunological Assay yang turut disponsori oleh PT. INDOGEN INTERTAMA.

Gambar 1. Workshop on Basic Immunological Assay

A. Waktu dan Tempat Pelaksanaan Webinar dan Workshop on Basic Immunological Assay

Webinar

Tanggal    : 25 November 2024

Tempat     : Online via Zoom

Workshop

Tanggal    : 26 November 2024

Tempat     : Lab Immunologi PAMITRAN UP Lt 3.

Jl. Prof. Eyckman No.38, Pasteur, Kec. Sukajadi, Kota Bandung, Jawa Barat

B. Penyampaian Materi Webinar dan Workshop

Webinar on Basic Immunological Assay

Workshop on Basic Immunological Assay

1.  Ex-Vivo Whole Blood Stimulation Assay (WBSA)

Gambar 2. Penyampaian Materi oleh Intan Maulia Warma Dewi, dr., M. A., Ph.D

Whole Blood Stimulation Assay (WBSA) adalah metode laboratorium yang dimaksudkan untuk menilai respons imun tubuh terhadap berbagai stimulus. Ini menilai imun bawaan (innate immunity) dan adaptif (adaptive immunity). Metode ini menggunakan darah utuh (whole blood) tanpa memisahkan komponen seperti plasma atau sel mononuklear. Ini menjaga lingkungan biologis alami selama analisis.

Teknik ini menggunakan stimulasi langsung darah utuh dengan agen seperti antigen, patogen, atau mitogen untuk memicu pelepasan mediator imun seperti sitokin dan kemokin. Analisis ini sangat penting untuk studi imunologi, diagnosis, dan penciptaan obat baru.

Poin penting dalam Whole Blood Stimulation Assay (WBSA) antara lain:

• Pastikan sampel darah yang masih fresh.
• Persiapan stimuli untuk WBSA dengan baik.
• Persiapan awal dengan menyalakan biosafety cabinet dan bersihkan dengan etanol 70%. Jika tidak melakukan prosedur di biosaferty cabinet, bisa dengan membersihkan meja kerja yang akan digunakan menggunakan etanol 70%. Kemudian, menyiapkan RPMI+++ stimuli minimal 30 menit sebelum memulai WBSA.
• Proses WBSA dengan cara melabel 24-well culture plate dengan tanggal, waktu, ID studi dan urutan stimulus. Siapkan semua stimulus dan RPMI di biosafety cabinet atau meja kerja. Untuk setiap donor, tuliskan nomor studi pada conical tube Homogenkan RPMI+++ hingga merata, lalu encerkan whole blood dengan pengenceran 5 kali menggunakan RPMI+++. (1,2 mL whole blood ditambah dengan 4,8 mL RPMI+++). Campur perlahan hingga homogen. Pipet 900 μL darah yang telah diencerkan ke dalam well yang sesuai pada 24-well culture plate. Gunakan tips yang sama untuk masing-masing donor. Tambahkan 100 μL stimulus yang telah di-aliquot ke well yang sesuai. Inkubasi plate di dalam inkubator pada suhu 37°C dengan konsentrasi CO₂ 5%. Pastikan inkubator tertutup rapat.
• Prosedur pasca inkubasi dengan pemrosesan sampel tidak perlu dilakukan secara steril. Siapkan tabung micronic yang sudah diberi label untuk setiap donor sesuai dengan tata letak di 24-well culture plate. Ambil 400 μL supernatant dari setiap well dan pindahkan ke dua tabung micronic/microcentrifuge. Simpan supernatant di suhu -80°C untuk penyimpanan jangka panjang. Jika akan melakukan pemeriksaan berupa ekspresi gen, pemeriksaan genetic/epigenetic, maupun immunophenotyping menggunakan metode flowcytometry, simpan whole blood sediments di suhu -80°C.

Gambar 3. Percobaan Hands on secara langsung untuk WBSA oleh peserta

2. Isolasi dan Penyimpanan Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC)

Gambar 4. Penyampaian Materi oleh Dr. rer. nat Afiat Berbudi, dr., M. Kes

Isolasi PBMC menggunakan sentrifugasi gradien densitas (density gradient) merupakan metode yang banyak digunakan untuk memisahkan sel mononuklear darah tepi dari sel darah lainnya. Prinsip di balik metode ini adalah bahwa berbagai jenis sel darah memiliki densitas yang berbeda, dan dapat dipisahkan dengan sentrifugasi menggunakan medium gradien densitas, seperti Ficoll atau Histopaque. Selama proses ini, seluruh sampel darah dicampur dengan medium gradien densitas dan disentrifugasi pada kecepatan dan waktu tertentu.

Hal ini menyebabkan sel-sel darah terpisah menjadi beberapa lapisan yang berbeda, dengan lapisan PBMC terbentuk pada lapisan antara plasma dan medium gradien densitas. Lapisan PBMC kemudian diambil dan dicuci untuk menghilangkan sel darah merah atau plasma yang terikut. PBMC yang dihasilkan kemudian dapat digunakan untuk berbagai aplikasi penelitian, seperti menyelidiki respons imun terhadap berbagai stimulus, mempelajari penyakit autoimun dan kanker, serta mengembangkan pengobatan baru. Isolasi PBMC menggunakan sentrifugasi gradien densitas membutuhkan peralatan dan reagen khusus, serta teknik dan prosedur yang tepat untuk mendapatkan PBMC berkualitas tinggi untuk tujuan penelitian. Larutan gradien densitas yang paling umum digunakan adalah Ficoll 1.077 (densitas: 1.077 g/mL).

Prosedur Isolasi PBMC:

1. Pemisahan PBMC dapat dilakukan dengan menggunakan tabung 15 ml atau 50 ml, tergantung pada jumlah sel terisolasi yang diinginkan.
2. Siapkan 3 ml darah utuh ke dalam tabung EDTA. Encerkan darah dengan menambahkan 1x volume darah (1:1) larutan buffer (PBS) kemudian campur dengan membalikkan tabung beberapa kali.
3. Siapkan tabung falcon (jika volume darah awal = 3 ml, gunakan tabung Falcon 15 ml; jika volume darah awal >4 ml, gunakan tabung Falcon 50 ml)
4. Siapkan larutan Ficoll Paque-Plus (GE Healthcare Life Sciences) ke dalam tabung falcon sebanyak 1x volume darah (3ml).
5. Pindahkan 6 ml darah yang telah diencerkan ke dalam tabung sentrifugasi yang berisi 3 ml Ficoll secara perlahan hingga membentuk lapisan dan tidak menyatu (darah yang telah diencerkan: Ficoll = 2:1).
6. Sentrifugasi dengan kecepatan 400 g selama 30-40 menit pada suhu 18°C tanpa rem (mode rem harus dimatikan/ mode brake off). Setelah sentrifugasi, tiga lapisan dapat dilihat. Pindahkan plasma dengan menggunakan pipet steril ke dalam cryotube sehingga tersisa lapisan putih yang mengandung sel mononuklear (PBMC) yang telah terpisah dari bagian lainnya.
7. Simpan cryotube yang telah diisi plasma pada suhu -80 derajat untuk kepentingan analisis protein plasma.

Pencucian PBMC

1. menggunakan pipet steril.
2. Tambahkan larutan buffer (PBS) hingga 3x volume PBMC, lalu pipet secara perlahan.
3. Sentrifugasi dengan kecepatan 400-500xg pada suhu 18-20°C selama 15 menit. Buang supernatan dan kemudian tambahkan 6-8 ml PBS kembali ke dalam pelet. Sentrifugasi dengan kecepatan 500xg (100xg untuk menghilangkan trombosit) selama 10 menit.
4. Buang supernatan, tambahkan media RPMI hingga volume 1 ml, dan resuspensi pelet.
5. Pelet siap untuk penghitungan atau penyimpanan sel.

Prosedur Pelisisan Sel Darah Merah

1. Campurkan 200 μl darah lengkap dengan 2 ml buffer lisis.
2. Inkubasi pada suhu kamar selama 5 menit
3. Sentrifugasi pada 300 x g untuk menghilangkan buffer lisis
4. Ulangi jika perlu.
5. Sel siap untuk analisis atau pewarnaan. Jika akan digunakan di lain waktu, lakukan cryopreservation.

Gambar 5. Percobaan Hands on PBMC secara langsung oleh peserta

3.  Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Pemeriksaan Kadar TNF-alfa

Gambar 6. Penyampaian Materi oleh Dr. Mohammad Ghozali, dr., M.Sc

Poin penting dalam Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Pemeriksaan Kadar TNF-alfa:

• Pastikan persiapan reagen yang tepat dan lengkap.
• Wajib menggunakan Alat Pelindung Diri (APD) (Jas laboratorium, masker, dan sarung tangan).
• Pengenceran standar beberapa konsentrasi setiap akan melakukan ELISA dengan rumus Y = (A-D)/(1+(X/C)^B) +D.
• Jangan lupa memberikan label pada tube.
• Dibuat Pengenceran Biotinylated Detection Ab 100 X, dengan Biotinylated Detection Ab Diluent (1:100).
• Dibuat Pengenceran HRP Conjugate 100 X, dengan HRP Conjugate Diluent (1:100).
• Pipetting ke 96-well plate secara berhati-hati agar tidak menyentuh dinding maupun dasar well-nya.

Gambar 7. Percobaan Hands on ELISA secara langsung oleh peserta

4. Pengenalan Produk PT. Indogen Intertama

Gambar 8. Penyampaian Materi oleh Dalli Mutia S. Si

Pemaparan beberapa produk yang disupply oleh Indogen yang didahului dengan pengenalan company profile PT Indogen Intertama. Kemudian, ditampilkan produk-produk Kit ELISA dari berbagai brand yang dibawa oleh Indogen seperti Elabscience, Cassio, Casino, Abcam, dan sebagainya. Lalu, memaparkan mengenai produk kit ELISA pre-coated series dan un-coated series. Selain itu, ditampilkan perbedaan kit ELISA Queckey Pro™, MS®, high sensitivity, dan traditional. Ditampilkan juga produk baru Elab science yaitu Ecoplex™ Kits. Perbedaan antara ELISA dan Multiplex Assay juga dipaparkan dengan point yang singkat dan jelas. Berikutnya, ditampilkan produk Assay Kit dari Elabscience, Bioassay System, Cayman, Megazyme, dan Cell Biolab Inc. Tidak lupa juga mengenai produk biologi molekuler dari Solarbio, Dakewe, Liferiver, dan Genmark. Terakhir dipresentasikan mengenai equipment atau alat yang telah didistribusikan oleh Indogen.

Pada workshop kali ini,  menggunakan TNF-Alfa ELISA kit dari brand Elabscience yang disponsori oleh PT. Indogen Intertama. Produk ini memiliki kode E-EL-H0109 dan dikenali sebagai Human TNF-α(Tumor Necrosis Factor Alpha) ELISA Kit dengan sebanyak 96 jumlah test, dan sensitivitas sebesar 4.69 pg/mL. Untuk produk lainnya seperti  IL-16, TNF-alpha, IL-1b dan 1L-8 ELISA Kit Merk Elabscience dapat ditemukan pembahasan lebih lanjut pada link berikut ini https://indogen.id/il-16-tnf-alpha-il-1b-dan-1l-8-elisa-kit-merk-elabscience/.

Daftar Pustaka

Hnasko, R.M, Lin A.V, Stanker, L. (2015). Methods in molecular biology: ELISA. 2nd ed. Springer Nature., Humana Press.

Generic – Self developed TNF-Alfa ELISA Kit