A. Transfer Gen Langsung

1.Transformasi Biolistik Dimediasi Partikel

Biolistik (balistik biologis) adalah proses peledakan (memasukkan secara paksa) fragmen DNA ke dalam sel dengan gen gun dengan mediasi partikel. Dalam metode ini, konstruksi DNA dilapisi pada mikropartikel dari emas atau tungsten. Pelet berlapis DNA ini kemudian ditempatkan di bagian depan peluru plastik dan kemudian ditembakkan ke sampel tanaman menggunakan gas helium bertekanan. Tekanan tinggi pada ruang helium memecahkan piringan dan memaksa peluru masuk ke batangan. Di ujung batangan, peluru akan berhenti tetapi partikel berlapis DNA akan keluar memasuki sampel biologis, sehingga terjadi pengiriman konstruksi DNA. Setelah integrasi DNA asing berhasil, proses perbaikan jaringan dimulai untuk memperbaiki kerusakan akibat biolistik.

Gambar 1. Alur transformasi Biolistik partikel.

Setelah transformasi jaringan tanaman, jaringan dipindahkan ke cawan kultur dengan kondisi seleksi yang sesuai untuk seleksi sel transgenik. Jaringan tanaman transgenik yang bertahan hidup dipindahkan ke media nutrisi yang sesuai. Karena sifat totipoten sel tumbuhan, tanaman transgenik baru akan terbentuk dari jaringan tertranformasi. Tanaman ini kemudian dibiarkan tumbuh dan menghasilkan benih biji.

Metode transformasi ini cukup efisien karena tidak terikat oleh kendala biologis dan dapat mentransformasi hampir semua jenis tanaman, tidak seperti Agrobacterium. Disamping itu, tidak ada batasan apapun mengenai bentuk, urutan atau ukuran DNA yang akan ditransformasikan. Namun, transformasi gene gun memiliki beberapa keterbatasan seperti memerlukan peralatan mahal, penyisipan pada beberapa situs dan menyebabkan kematian sel.

1.Ekspresi Kloroplas

Introduksi transgen ke dalam plastida melalui transformasi dimediasi partikel dikenal sebagai ekspresi kloroplas. Kloroplas memiliki kumpulan materi genetik tersendiri yang disebut plastoma. Plastoma merupakan tempat berlangsungnya integrasi gen asing. Transformasi plastoma memiliki ciri-ciri unik tertentu seperti:

1. integrasi gen mudah dan spesifik,
2. kurangnya efek posisi dan pembungkaman gen
3. ekspresi gen tinggi
4. ekspresi polisistronik
5. pencegahan pelepasan transgen akibat pewarisan genom plastida maternal
6. panen protein sebelum kematangan reproduksi (menjamin pengendalian transgen)
7. kisaran host yang sempit

Jika genom kloroplas sudah diurutkan, maka transformasinya menjadi lebih mudah melalui rekombinasi homolog. Kaset transgenik disisipkan di antara dua gen kloroplas fungsional dengan memanfaatkan dua daerah terapit yang diketahui pada genom kloroplas.

Dikarenakan proteksi membran ganda pada kloroplas, metode transformasi cukup sulit dibandingkan dengan transformasi genom inti. Namun, penggunaan metode yang dimediasi gene gun cukup berhasil dalam beberapa transformasi kloroplas. Banyak kloroplas mengekspresikan banyak salinan gen di setiap sel, sehingga menghasilkan hasil protein yang tinggi (sekitar 70% protein pada daun).

Transformasi dimediasi Agrobacterium bukanlah alternatif untuk transformasi kloroplas karena protein vir Ti-plasmid secara alami menargetkan T-DNA ke nukleus. Dengan demikian, metode lain yang meyakinkan dan terjangkau untuk transformasi kloroplas misalnya melibatkan penggunaan polietilen glikol (PEG) dapat digunakan. PEG berfungsi untuk menghilangkan dinding sel dan sel kemudian dipaparkan pada DNA terpurifikasi. Meskipun tidak mahal dibandingkan gene gun, metode ini memiliki efisiensi transformasi yang rendah dan sulit dilakukan.

Tabel 1. Transformasi genetik kit untuk tanaman dan khamir.

Setelah transformasi awal, sel tumbuhan heteroplasmik menghasilkan beberapa kloroplas tertransformasi. Sel-sel tersebut diujikan pada beberapa seleksi antibiotik untuk mencapai kondisi homoplasmi. Seleksi antibiotik akan menyebabkan penurunan jumlah kloroplas secara drastis dan mendorong pembelahan kloroplas yang tersisa selama pembelahan sel. Setelah mencapai homoplasmi, marker antibiotik dikeluarkan dari plastoma dengan metode berbeda, contohnya rekombinasi CreLoxP. Jaringan transplastomik kemudian dikultur untuk menghasilkan tanaman dewasa.

Tabel 2. Enzim dalam transformasi genetik.

Tabel 3. Pelabelan fluorescens dalam rekombinasi genetik tanaman.

Tabel 4. Produk IPTG dan PEG

Referensi:

1. Karl-Hermann Kumar, Ashwani Imani, Jafargholi Neumann. 2020. Plant Cell And Tissue Culture: A Tool In Biotechnology: Basics And Application. Springer Nature.
2. Kaiser Iqbal Wani, Tariq Aftab. 2022. Plant Molecular Farming: Applications and New Directions. SpringerBriefs in Plant Science. Springer.

Artikel Terkait:

1. Indikator-Indikator Senyawa Pada Kejadian Stres Tanaman [link]
2. Assay Kit Untuk Industri Sereal dan Dietary Fiber dari Megazyme [link]
3. Fitokimia: Ekstraksi, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Bioaktif Ekstrak Tanaman [link]
4. Fitokimia Bagian 2: Ekstraksi, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Bioaktif Ekstrak Tanaman [link]
5. 6 Metode Deteksi Protein Yang Paling Umum Digunakan [link]
6. 3 Metode Deteksi Protein dari Merk Elabscience [link]
7. Isolasi dan Purifikasi Protein dengan Kit Komersial [link]
8. Assay Kit Deteksi Enzim Antioksidan pada Manusia [link]
9. Pengukuran Berbagai Marker Enzim dari Merk Elabscience [link]
10. 4 Marker Senyawa Yang Terlibat Siklus TCA (Tricarboxylic acid) [link]
11. Kit Metabolisme Lipid dari Merk Elabscience [link]