Gambar 1. Foto Bersama Tim FineTest

“Behind every reliable research result lies not only high-quality reagents, but also a thorough understanding of the scientific principles and laboratory techniques behind every experiment.”

Pendahuluan

Dalam penelitian biomedis, analisis protein memiliki peran penting dalam memahami berbagai proses biologis, mulai dari regulasi ekspresi gen, mekanisme penyakit, hingga evaluasi efektivitas suatu terapi. Oleh karena itu, berbagai teknik analisis protein terus dikembangkan untuk menghasilkan data yang semakin akurat dan dapat direproduksi. Di antara berbagai metode yang tersedia, Western Blot dan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) masih menjadi dua teknik yang paling banyak digunakan karena menawarkan sensitivitas dan spesifisitas tinggi dalam mendeteksi protein target.

Sebagai bagian dari komitmen untuk terus meningkatkan kualitas layanan kepada pelanggan, PT Indogen Intertama berkesempatan mengikuti Pelatihan Western Blot dan ELISA yang diselenggarakan oleh FineTest di laboratoriumnya di Wuhan, China, pada 6 – 8 Juli 2026. Selama tiga hari pelatihan, kami mempelajari teori dan praktik kedua metode tersebut secara langsung bersama tim FineTest, sekaligus berdiskusi mengenai berbagai tantangan yang umum ditemui dalam analisis protein.

Pelatihan Western Blot dilakukan pada 6 – 7 Juli 2026 dipandu oleh Lee Guo dan Li Zong Li, sedangkan sesi Sandwich ELISA pada 8 Juli 2026 dipandu oleh Cody. Selama kegiatan berlangsung, kami juga didampingi oleh Jenny selaku Sales Manager FineTest, serta disambut baik oleh Camille dan Zecky dari tim Sales serta Judy, dan Water selaku Laboratory Manager. Suasana pelatihan yang interaktif memberikan kesempatan bagi kami untuk tidak hanya mempelajari prosedur laboratorium, tetapi juga berdiskusi mengenai pengalaman praktis dan penerapan metode dalam berbagai aplikasi penelitian.

Western Blot: Memahami Tahapan Kritis dalam Deteksi Protein

Pada dua hari pertama pelatihan difokuskan pada aplikasi Western Blot, salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam penelitian biologi molekuler untuk mendeteksi protein spesifik. Selama sesi ini, kami didampingi oleh Lee Guo dan Li Zong Li, yang menjelaskan bagaimana alur kerja Western Blot secara menyeluruh, mulai dari persiapan sampel hingga interpretasi hasil. Tim FineTest menjelaskan bahwa kualitas hasil Western Blot sangat dipengaruhi oleh setiap tahapan prosedur. Kesalahan kecil pada satu langkah dapat berdampak pada keseluruhan hasil analisis.

Gambar 2. Foto bersama technical yang mendampingi pelatihan Western Blot

Tahapan pertama yang dipelajari adalah persiapan sampel protein. Sampel jaringan atau sel terlebih dahulu dilisis untuk memperoleh protein, kemudian konsentrasinya diukur menggunakan metode BCA (Bicinchoninic Acid) assay. Pengukuran ini bertujuan memastikan jumlah protein yang dimuat ke dalam gel seragam sehingga hasil yang diperoleh dapat dibandingkan secara akurat. Sebelum dimuat ke dalam gel, protein dicampur dengan 5x loading buffer dengan konsentrasi 40μl sampel dan 10μl 5x loading buffer. Kemudian dipanaskan pada suhu 95°C selama 5 menit untuk mendenaturasi struktur protein. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada 12,000rpm selama 2 menit. Supernatan dapat langsung digunakan atau dapat disimpan pada suhu -20°C. Berikut adalah sampel yang digunakan dalam pengujian western blot tersebut.

Image	Deskripsi
Gambar 3. Jenis sampel yang digunakan dalam analisis Western Blot	Mouse Liver, Lo2, Rat Liver, Mouse Kidney, Rat Kidney, Rat Testis     U-87, Jurkat, HeLa, HepG2, Rat Testis, Mouse Brain, Rat Heart     HepG2, Rat Liver, Mouse Liver, LO2, MCF-7, Rat Kidney, Mouse Kidney     HeLa, Rat Lung, Mouse Lung, U2OS, Mouse Brain, Rat Brain, NIH/3T3

Sebelum proses elektroforesis dilakukan, kami terlebih dahulu mempelajari proses pembuatan gel SDS-PAGE yang terdiri atas resolving gel dan stacking gel. Tim FineTest menjelaskan bahwa kedua lapisan gel memiliki fungsi yang berbeda. Stacking gel berperan mengkonsentrasikan protein menjadi pita yang tipis sebelum memasuki resolving gel, sedangkan resolving gel berfungsi memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Kombinasi kedua lapisan tersebut membantu menghasilkan resolusi pita protein yang lebih baik sehingga memudahkan proses analisis selanjutnya.

Gambar 4. Persiapan gel SDS-Page yang telah dibuat sebelumnya sebelum dimasukan ke dalam tangki

Setelah proses polimerisasi selesai, gel dipasang pada tangki elektroforesis dan diisi dengan loading buffer. Sampel yang telah disiapkan sebelumnya ditambahkan pada sumur gel sebanyak 10μl untuk setiap sumur. Selain sampel, protein molecular weight marker juga dimuat sebagai acuan untuk memperkirakan ukuran protein target setelah proses pemisahan selesai. Dalam analisis kali ini ditambahkan marker 10-250kDa sebanyak 1μl, dan dibuat 2 sumur yang mengandung marker tersebut.

Tim FineTest juga menekankan pentingnya teknik sample loading yang benar. Kesalahan saat memasukkan sampel, seperti terbentuknya gelembung udara atau volume yang tidak konsisten, dapat menyebabkan pita protein menjadi tidak rata (smiling bands), bercampur dengan sumur lain, atau bahkan hilang selama proses elektroforesis. Oleh karena itu, ketelitian pada tahap awal ini menjadi salah satu faktor yang menentukan kualitas hasil Western Blot secara keseluruhan.

Image	Image
Gambar 5. Proses pemasangan gel pada tangki elektroforesis	Gambar 6. Penambahan loading buffer sebanyak 1L pada tangki
Gambar 7. Proses membuang bubble pada bagian dalam tangki	Gambar 8. Proses penambahan loading buffer pada tangki
Gambar 9. Tim Indogen mencoba untuk loading sampel 1	Gambar 9. Tim Indogen mencoba untuk loading sampel 2

Selanjutnya, protein dipisahkan menggunakan SDS-PAGE. Dalam pelatihan, proses elektroforesis (Gambar 10) dilakukan secara bertahap menggunakan tegangan 80 V hingga bromophenol blue dye bermigrasi dari stacking gel memasuki separating gel dengan estimasi waktu 30 menit. Kemudian voltase dinaikkan menjadi 120 V selama 90 menit hingga bromophenol blue mencapai dasar (bagian bawah) gel sebagai tanda bahwa proses pemisahan selesai. Pada tahap ini, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) memberikan muatan negatif yang relatif seragam pada protein sehingga migrasi protein di dalam gel terutama ditentukan oleh ukuran molekulnya.

Gambar 10. Proses elektroforesis

Setelah proses elektroforesis selesai, protein ditransfer ke membran nitroselulosa menggunakan sistem transfer basah (wet transfer). Gel dikeluarkan terlebih dahulu dari pelat kaca dan dipotong sedikit di salah satu sudut gel untuk mengidentifikasi urutan pembuatan setelah pewarnaan dan pengeringan (Gambar 11). Pada analisis kali ini, tim FineTest menggunakan NC membrane yang ukurannya sudah disesuaikan dengan ukuran gel dan direndam pada transfer buffer selama minimal 5 menit sebelum digunakan. Transfer buffer ini merupakan loading buffer yang ditambah dengan 20% methanol. Dalam penjepit transfer, tempatkan secara berurutan dari kutub negatif ke positif sebagai berikut (Gambar 12).

Sponge pre-soaked in transfer buffer  → Tiga lembar kertas saring → Gel → NC membrane → Tiga lembar kertas saring —> Sponge pre-soaked in transfer buffer

Selanjutnya, tempatkan penjepit transfer ke dalam tangki transfer yang sudah diisi penuh dengan transfer buffer (Gambar 14). Dimana membran menghadap kutub positif dan gel menghadap kutub negatif (Gambar 15). Letakan seluruh tangki dalam penangas es-air (Gambar 16). Transfer pada arus konstan selama 200mA selama 1 – 2 jam. Untuk gel 12%, transfer selama 60 menit sedangkan untuk gel 6 – 8% selama 120 menit.

Image	Image
Gambar 11. Proses pemotongan gel	Gambar 12. Proses layering
Gambar 13. Penyimpanan transfer kaset ke dalam transfer tank	Gambar 14. Proses penambahan transfer buffer
Gambar 15. Proses pemasangan	Gambar 16. Penambahan ice pada wadah tangki transfer

Tahap berikutnya adalah blocking, yaitu merendam membran dalam larutan 5% skim milk dalam TBST selama satu jam. Awalnya ditambahkan 2.5g non-fat dry milk ke dalam 50mL TBST dan 25μl PC300 sebagai preservatif untuk mencegah pertumbuhan mikroba. Blocking bertujuan menutupi area membran yang tidak mengandung protein sehingga mengurangi ikatan antibodi yang tidak spesifik dan menghasilkan background yang lebih rendah. Tim FineTest juga mengingatkan pentingnya menjaga membran tetap lembab selama proses inkubasi dan pencucian karena membran yang mengering dapat meningkatkan sinyal non-spesifik.

Image	Image
Gambar 17. Penyiapan 5% non-fat dry milk	Gambar 18. Pemindahan membran ke dalam wadah yang berisi transfer buffer
Gambar 19. Proses membuang buffer	Gambar 20. Proses pemotongan membran dan pemisahan weight marker
Gambar 21. Penambahan 5% non-fat dry milk + PBS	Gambar 22. Inkubasi pada suhu ruang selama 1 jam pada shaker

Proses kemudian dilanjutkan dengan inkubasi menggunakan primary antibody, diikuti pencucian menggunakan TBST dan inkubasi secondary antibody berlabel horseradish peroxidase (HRP). Kombinasi kedua antibodi ini memungkinkan protein target dikenali secara spesifik sebelum memasuki tahap deteksi. Sebelum penambahan antibodi, larutan blocking dibuang terlebih dahulu (Gambar 23) dan ditambahkan TBST dan PC300 pada wadah (Gambar 24 & 25) baru setelah itu ditambahkan antibodi primer (Gambar 26). Adapun untuk antibodi yang digunakan yakni produk dari FineTest dengan dilusi 1:1000 dengan rincian 50mL TBST + 10μg primary antibody + 25μl PC300.

Pada analisi kali ini digunakan 4 jenis antibodi yang berbeda seperti pada Gambar 27. Setelah itu kemudian wadah ditutup dan dilakukan inkubasi selama overnight pada suhu ruang pada shaker. Sebagai tips saat menuangkan TBST atau cairan lainnya, akan lebih baik jika dituangkan pada ruang kosong di samping membran.

Image	Image
Gambar 23. Proses membuang larutan Blocking	Gambar 24. Penambahan TBST
Gambar 25. Penambahan PC300	Gambar 26. Penambahan Antibodi Primer
Gambar 27. Antibodi primer yang ditambahkan pada sampel	Gambar 28. Sampel yang akan diinkubasi semalaman

Setelah inkubasi primer selesai, larutan pada wadah kemudian dibuang dan dilakukan pencucian dengan TBST selama 4 kali dengan masing-masing pencucian selama 5 menit. Kemudian, ditambahkan antibodi IgG anti-kelinci kambing berlabel HRP sebagai antibodi sekunder dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Antibodi yang ditambahkan sebanyak 2.5μl ditambah 50 mL TBST dan 25μl PC300. Apabila waktu inkubasi selesai, maka dilanjutkan dengan tahapan pencucian banyak 4x dengan TBST masing-masing selama 5 menit (Gambar 29).

Tahapan selanjutnya yakni kemiluminesensi dan eksposur. Deteksi dilakukan menggunakan sistem Enhanced Chemiluminescence (ECL). Pada prinsipnya, reaksi antara substrat ECL dan enzim HRP menghasilkan sinyal cahaya yang kemudian direkam menggunakan film untuk menghasilkan pita protein (protein bands). Tahapan ini diawali dengan penambahan komponen A dan B dari kit ECL dengan perbandingan 1:1. Kemudian membran diletakan pada pelat dan diposisikan protein molecular weight marker di samping membran. Ditambahkan larutan ECL sebanyak 200μl di atas membran dan marker kemudian masukan ke dalam alat Chemiluminescence Imaging System.

Image	Image
Gambar 29. Pencucian dengan TBST setelah inkubasi antibodi sekunder	Gambar 30. Komponen pada kit ECL
Gambar 31. Penambahan ECL pada membrane dan marker	Gambar 32. Pelat dimasukan ke dalam alat

Sebagai ringkasan kegiatan kembali, analisis dilakukan menggunakan gel poliakrilamida dengan konsentrasi 8%. Proses elektroforesis diawali pada tegangan 80 V selama 30 menit, kemudian dilanjutkan pada 120 V hingga tracking dye bromophenol blue mencapai bagian bawah gel. Selanjutnya, protein dipindahkan ke membran melalui proses transfer menggunakan arus konstan sebesar 200 mA selama 1,5 jam. Pada tahap imunodeteksi, antibodi primer digunakan dengan pengenceran 1:1000 sebelum dilanjutkan ke tahapan berikutnya.

Berikut adalah hasil dan interpretasi dari kegiatan analisis Western Blot tersebut.

Catalog	Nama Produk	Hasil	Interpretasi
FNab04524	KHK antibody		A target band at 33 kDa was detected. Non-specific bands above 50 kDa were observed in LO2 samples.
FNab06355	PGK2 antibody		A target band at 45 kDa was detected. Non-specific bands at 60 kDa were observed in HeLa samples.
FNab05048	MCCC2 antibody		A target band at 64 kDa was detected, with non-specific bands observed in cell samples. The protein has two isoforms with molecular weights of 57 kDa and 61 kDa, which may result in double-band patterns. The high background issue can be improved by reducing the Loading amount.
FNab09381	VCP antibody		A single specific band of the target protein was detected.

ELISA: Memahami Conventional dan QuickTest ELISA brand FineTest

Gambar 33. Foto bersama Cody, Technical Support FineTest

Setelah mempelajari Western Blot, pelatihan dilanjutkan dengan mengenal lebih lanjut ELISA yang dipandu oleh Cody. Pada kegiatan ini digunakan 2 jenis ELISA kit yakni Human IL-6 ELISA Kit (EH0201) dan Human IL-6 QuickTest ELISA Kit (QT-EH0201) dari FineTest. Kedua kit tersebut menggunakan prinsip double-antibody sandwich ELISA, yaitu metode yang memanfaatkan dua antibodi berbeda untuk menangkap dan mendeteksi protein target sehingga menghasilkan spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi dalam pengukuran protein. Berbeda dengan Western Blot yang digunakan untuk mengidentifikasi protein berdasarkan ukuran molekul, Sandwich ELISA dirancang untuk mengukur konsentrasi protein target secara kuantitatif menggunakan pasangan antibodi yang mengenali epitop berbeda pada protein yang sama.

Image	Deskripsi
Gambar 34. Dua jenis ELISA Kit yang digunakan pada analisis
Gambar 35. Perbedaan antibodi deteksi pada FineTest Cat. EH0201 dengan QT-EH0201	Pada Conventional ELISA, antibodi deteksi dan larutan pengencer disediakan secara terpisah sehingga pengguna perlu melakukan proses rekonstitusi atau pengenceran sebelum digunakan.   Sebaliknya, QuickTest ELISA menggunakan reagen Cap/Det Ab (Capture/Detection Antibody) yang telah diformulasikan siap pakai sehingga mengurangi tahapan persiapan reagen dan meminimalkan potensi kesalahan pipetting.
Gambar 36. Perbedaan HRP-Streptavidin pada FineTest Cat. EH0201 dengan QT-EH0201	Pada Conventional ELISA, HRP-Streptavidin harus terlebih dahulu diencerkan menggunakan larutan SABC Dilution sebelum digunakan.   Pada QuickTest ELISA, HRP-Streptavidin tersedia dalam bentuk siap pakai sehingga tahapan preparasi reagen dapat dieliminasi.
Gambar 37. Perbedaan Sample Dilution pada FineTest Cat. EH0201 dengan QT-EH0201	Baik Conventional ELISA maupun QuickTest ELISA menggunakan Sample Dilution sebagai media untuk mengencerkan sampel sebelum analisis.     Pada QuickTest ELISA, Sample Dilution berwarna biru memiliki formulasi yang telah dioptimalkan untuk mendukung proses inkubasi yang lebih singkat sehingga tetap mampu mempertahankan sensitivitas pengujian.
Gambar 38. Perbedaan standard pada FineTest Cat. EH0201 dengan QT-EH0201	Pada Conventional ELISA terdapat standar sebesar 300 pg/mL, sedangkan QuickTest ELISA terdapat standar sebesar 30 pg/mL.   Perbedaan ini menunjukkan bahwa QuickTest dirancang untuk pengukuran pada rentang konsentrasi yang lebih rendah (low abundance), sehingga dapat menjadi pilihan yang sesuai untuk sampel dengan kadar analit rendah, di samping keunggulannya dalam waktu analisis yang lebih singkat.
Gambar 39. Persamaan antara FineTest Cat. EH0201 dengan QT-EH0201	Baik pada conventional ataupun QuickTest terdapat 25x wash buffer, TMB Substrate dan Stop Solution dengan kuantitas yang sama.

Selain terdapat perbedaan pada komponen, prosedur kerja antara kedua kit tersebut juga berbeda. Berikut adalah perbedaan dari ringkasan prosedur kerja antara EH0201 dengan QT-EH0201.

EH0201	QT-EH0201
Conventional ELISA (EH0201)	QuickTest ELISA (QT-EH0201)
Gambar 40. Workflow EH0201   Prosedur kerja dengan 5 tahapan dan total waktu pengerjaan selama ± 4 jam.	Gambar 41. Workflow QT-EH0201   Prosedur kerja dengan 4 tahapan dan total waktu pengerjaan selama ± 2 jam.

Berikut adalah prosedur kerja secara umum yang kami lakukan saat analisis kedua kit tersebut

Image	Image
Gambar 40. Pembuatan Wash Buffer	Gambar 41. Sampel inflamed dan healthy human serum untuk EH0201
Gambar 42. Pembuatan serial dilusi untuk EH0201	Gambar 43. Pembuatan serial dilusi untuk QT-EH0201
Gambar 44. Well Plate EH0201	Gambar 45. Well Plate QT-EH0201
Gambar 46. Proses inkubasi well plate	Gambar 47. Proses pencucian secara otomatis
Gambar 48. Proses pencucian secara manual 1	Gambar 48. Proses pencucian secara manual 2
Gambar 49. Proses penambahan biotin-labeled antibody pada EH0201	Gambar 50. Penambahan HRP-Streptavidin
Gambar 51. Penambahan TMB Substrate	Gambar 52. Penambahan Stop Solution
Gambar 53. Well Plate EH0201 setelah penambahan stop solution	Gambar 54. Well Plate QT-EH0201 setelah penambahan stop solution
Gambar 55. Proses loading well plate pada ELISA reader	Gambar 56. Proses Analisa Data

 Evaluasi Kurva Standard

Setelah seluruh tahapan Sandwich ELISA selesai dilakukan, mulai dari preparasi standar, inkubasi, pencucian, penambahan substrat TMB, hingga penghentian reaksi menggunakan stop solution, absorbansi masing-masing standar diukur pada panjang gelombang 450 nm menggunakan microplate reader. Nilai absorbansi tersebut kemudian digunakan untuk membentuk kurva standar (standard curve) yang menjadi dasar dalam menghitung konsentrasi analit pada sampel. Berikut analisis data dari EH0201 dan QT-EH02021.

EH0201 Human IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit
MMF Model: y=(a*b+c*x^d)/(b+x^d) Coefficient Data: a =         1.35080087875E-002 b =         5.17888406270E+002 c =         5.05980523430E+000 d =         1.07049842302E+000	r = 0,99992489
QT-EH0201 Human IL-6(Interleukin 6) QuickTest ELISA Kit
MMF Model: y=(a*b+c*x^d)/(b+x^d) Coefficient Data: a =         1.12180798817E-006 b =         2.79177179091E+006 c =         2.79177066260E+006 d =         1.00000115093E+000	r = 1,00000000

Hasil analisis menunjukkan bahwa Conventional Human IL-6 ELISA Kit menghasilkan nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,9999, sedangkan Human IL-6 QuickTest ELISA Kit menghasilkan nilai r sebesar 1,0000. Kedua nilai tersebut menunjukkan hubungan yang sangat kuat antara konsentrasi standar dengan nilai absorbansi (OD450), sehingga kurva standar yang dihasilkan memiliki kualitas yang sangat baik dan memenuhi persyaratan untuk analisis kuantitatif.

Pada Conventional ELISA, seluruh titik standar berada sangat dekat dengan kurva regresi sehingga menghasilkan hubungan yang hampir sempurna antara konsentrasi dan absorbansi. Sementara itu, pada QuickTest ELISA, seluruh titik standar berada tepat pada garis regresi dengan nilai r = 1,0000 yang menunjukkan bahwa setiap titik standar memiliki kesesuaian yang sangat tinggi terhadap model kurva yang digunakan. Hasil ini mencerminkan konsistensi yang sangat baik selama proses preparasi reagen, pengenceran standar secara bertingkat (serial dilution), pemipetan, inkubasi, pencucian, hingga pembacaan absorbansi menggunakan microplate reader.

Meskipun QuickTest ELISA memiliki alur kerja yang lebih sederhana dengan jumlah tahapan inkubasi yang lebih sedikit dibandingkan Conventional ELISA, hasil pengujian menunjukkan bahwa penyederhanaan workflow tersebut tetap mampu menghasilkan kurva standar dengan kualitas yang sangat baik. Hal ini menunjukkan bahwa optimalisasi formulasi reagen pada QuickTest ELISA tetap dapat mempertahankan performa analisis tanpa mengurangi kualitas hasil pengukuran.

Secara keseluruhan, hasil praktikum menunjukkan bahwa baik Conventional ELISA maupun QuickTest ELISA mampu menghasilkan kurva standar dengan linearitas yang sangat baik. Kurva standar yang optimal merupakan salah satu indikator penting keberhasilan analisis ELISA karena berpengaruh langsung terhadap ketepatan dan keandalan proses kuantifikasi sampel.