Pendahuluan

Lentiviral vector merupakan salah satu platform yang banyak digunakan dalam penelitian molecular biology dan gene delivery karena mampu menghantarkan materi genetik ke berbagai jenis sel. Penghantaran ini termasuk sel yang sedang membelah maupun tidak membelah. Salah satu tahapan penting dalam pemanfaatan lentiviral vector adalah proses lentivirus packaging yaitu penyediaan komponen-komponen yang diperlukan untuk membentuk partikel lentiviral rekombinan yang membawa gene of interest. Dalam beberapa workflow penelitian, gene of interest perlu diperoleh atau dimodifikasi terlebih dahulu sebelum digunakan dalam konstruksi vector. Untuk kebutuhan tersebut, proses seperti gene synthesis, DNA fragment, dan plasmid DNA preparation dapat menjadi bagian dari workflow penelitian.

Secara umum, sistem lentivirus packaging melibatkan transfer plasmid, packaging plasmid, dan envelope plasmid. Transfer plasmid membawa gene of interest yang akan dihantarkan, packaging plasmid menyediakan protein viral yang diperlukan untuk pembentukan partikel lentiviral, sedangkan envelope plasmid menyediakan protein permukaan yang membantu proses masuknya partikel ke sel target. Susunan komponen packaging tersebut dapat berbeda berdasarkan generasi sistem yang digunakan. Pada sistem generasi ke-2, komponen packaging utama berada dalam satu plasmid, sedangkan pada sistem generasi ke-3 komponen tersebut dipisahkan ke dalam dua plasmid. Perbedaan inilah yang menjadi salah satu karakteristik utama antara sistem lentivirus packaging generasi ke-2 dan ke-3.

Gambar 1. Lentiviral Vectors dan Lentivirus Workflow

Gambar di atas menunjukkan alur kerja penggunaan lentiviral vector untuk menghasilkan dan menghantarkan gen target ke dalam sel. Proses dimulai dari lentiviral vector yang membawa gen target, kemudian dilakukan tahap packaging menggunakan packaging mix generasi kedua atau ketiga untuk membentuk partikel lentivirus. Lentivirus yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk melakukan transduction pada sel target, sehingga materi genetik yang dibawa oleh vector dapat masuk ke dalam sel dan memungkinkan ekspresi gen target. Setelah proses tersebut, keberhasilan delivery dapat dievaluasi melalui perubahan ekspresi gen, yaitu dengan membandingkan tingkat ekspresi gen target pada sel yang telah ditransduksi dengan sel kontrol atau wild type.  Secara keseluruhan, workflow ini menggambarkan rangkaian lentiviral vector → packaging → pembentukan lentivirus → transduction sel target → perubahan ekspresi gen.

Apa Saja Komponen dalam Lentivirus Packaging?

Untuk memahami lentivirus packaging, penting untuk membedakan fungsi setiap komponen. Secara sederhana, transfer plasmid membawa materi genetik yang ingin dihantarkan, sedangkan plasmid packaging dan envelope menyediakan komponen yang dibutuhkan untuk pembentukan partikel lentiviral.

1. Transfer Plasmid

Transfer plasmid merupakan plasmid yang membawa gene of interest (GOI) atau materi genetik yang ingin dihantarkan ke sel target. Transfer vector dirancang sedemikian rupa sehingga elemen yang diperlukan untuk pengemasan genom lentiviral tetap tersedia, sementara sebagian besar gen viral yang diperlukan untuk pembentukan partikel disediakan secara terpisah melalui packaging system.

Dalam sistem ABMGood, lentiviral expression vectors yang dipasarkan merupakan third-generation lentiviral vectors dan memiliki chimeric RSV promoter pada upstream 5′ LTR. Vector tersebut dapat digunakan dengan sistem packaging generasi ke-2 maupun generasi ke-3 sesuai kompatibilitas sistemnya. Dengan demikian, pemilihan transfer plasmid perlu menjadi salah satu pertimbangan sebelum menentukan packaging system yang akan digunakan.

2. Packaging Plasmid

Packaging plasmid menyediakan protein viral yang diperlukan untuk pembentukan partikel lentiviral, tetapi tidak dirancang untuk membawa gene of interest. Beberapa komponen penting di dalamnya antara lain:

• Gag berperan dalam pembentukan struktur partikel virus;
• Pol mengodekan protein dengan fungsi enzimatik yang diperlukan dalam siklus hidup lentivirus;
• Rev berperan dalam regulasi ekspor RNA viral;
• Tat terdapat pada sistem generasi tertentu dan berkaitan dengan aktivasi transkripsi LTR.

Perbedaan utama sistem generasi ke-2 dan ke-3 terletak pada bagaimana fungsi-fungsi tersebut dipisahkan ke dalam plasmid packaging. Pada 2nd Generation Packaging Mix ABMGood (Cat. No. LV003), protein Gag, Pol, Tat, dan Rev terdapat dalam satu packaging plasmid. Sistem ini kemudian dikombinasikan dengan envelope plasmid sehingga secara keseluruhan digunakan tiga plasmid yakni transfer plasmid, packaging plasmid, dan envelope plasmid.

Gambar 2. Produk Packaging Generasi ke-2 dari ABMGood

Sementara itu, 3rd Generation Packaging Mix ABMGood (Cat. No. LV053) memisahkan fungsi packaging menjadi dua plasmid. Dimana satu membawa Gag dan Pol, sedangkan plasmid lainnya membawa Rev. Bersama transfer plasmid dan envelope plasmid, sistem ini menggunakan empat plasmid.

Gambar 3. Produk Packaging Generasi ke-3 dari ABMGood

3. Envelope Plasmid

Envelope plasmid menyediakan protein envelope yang berada pada permukaan partikel lentiviral. Komponen ini berperan penting dalam interaksi partikel dengan sel target dan proses masuknya partikel ke dalam sel. Salah satu envelope yang umum digunakan dalam lentivirus packaging adalah VSV-G (Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein). ABMGood menggunakan VSV-G sebagai envelope pada packaging system-nya, dan envelope tersebut dirancang sebagai komponen yang dapat digunakan secara interchangeable dalam sistem packaging. Dengan adanya envelope plasmid, sistem packaging dapat menghasilkan partikel lentiviral yang memiliki komponen permukaan yang diperlukan untuk proses delivery ke sel target.

Memahami Perbedaan Lentivirus Packaging Generasi ke-2 dan ke-3

Salah satu pertanyaan yang sering muncul dalam pemilihan lentivirus packaging system adalah: lebih baik menggunakan generasi ke-2 atau generasi ke-3?

Jawabannya bergantung pada kebutuhan eksperimen, kompatibilitas transfer vector, serta pertimbangan biosafety.

ABMGood menyatakan bahwa sistem generasi ke-2 menggunakan tiga plasmid, sedangkan sistem generasi ke-3 menggunakan empat plasmid dengan Rev dipisahkan dari Gag dan Pol. Pemisahan tersebut memberikan tingkat pemisahan fungsi viral yang lebih tinggi dan mengurangi kemungkinan terjadinya rekombinasi yang menghasilkan virus wild-type. Dari sisi yield, ABMGood juga melaporkan bahwa sistem generasi ke-2 cenderung memberikan yield yang lebih tinggi dibandingkan generasi ke-3 karena jumlah plasmid yang perlu digunakan lebih sedikit. Sebaliknya, sistem generasi ke-3 lebih ditujukan bagi pengguna yang memprioritaskan biosafety.

Titrasi Lentivirus: Mengapa Penting?

Setelah lentiviral particles diperoleh, salah satu tahapan penting berikutnya adalah menentukan titer. Titer memberikan informasi kuantitatif mengenai jumlah lentiviral material dalam suatu preparasi dan membantu peneliti menentukan konsistensi serta kebutuhan penggunaan virus dalam eksperimen berikutnya.

ABMGood menyediakan qPCR Lentivirus Titer Kit ViralEntry™ Bundle (Cat. No. LV900) untuk membantu proses titrasi lentivirus. Kit ini menggunakan pendekatan qPCR/RT-qPCR untuk mendeteksi target pada lentiviral material dan dirancang sebagai assay yang cepat serta sensitif. ABMGood juga mencantumkan LV900 sebagai produk pendukung pada workflow lentivirus packaging.

Purifikasi dan Konsentrasi Lentivirus

Dalam beberapa aplikasi, viral supernatant yang diperoleh mungkin memerlukan proses purification atau concentration sebelum digunakan lebih lanjut. ABMGood menyediakan Speedy Lentivirus Purification (Cat. No. LV999) yang dirancang untuk membantu memurnikan dan mengonsentrasikan lentiviral particles. Berdasarkan informasi produk ABMGood, produk ini dapat digunakan untuk membantu meningkatkan konsentrasi lentiviral particles hingga 100×. ABMGood juga menyediakan Ultra-Pure Lentivirus Purification Kit (Cat. No. LV998) sebagai salah satu pilihan purification dalam portfolio lentivirus-nya. Dengan demikian, kebutuhan lentivirus tidak hanya berhenti pada tahap packaging. Workflow dapat dilanjutkan dengan titrasi, purification, dan concentration sesuai kebutuhan aplikasi penelitian.

Bagaimana Memilih Packaging System yang Tepat?

Pemilihan antara sistem generasi ke-2 dan ke-3 sebaiknya mempertimbangkan beberapa hal:

1. Periksa generasi transfer vector
   Pastikan transfer plasmid yang digunakan kompatibel dengan packaging system yang dipilih. Third-generation packaging system ABMGood misalnya ditujukan untuk third-generation, Tat-independent transfer vectors.

2. Pertimbangkan kebutuhan biosafety
   Jika pemisahan komponen viral menjadi pertimbangan utama, third-generation system menawarkan pemisahan fungsi viral yang lebih jauh.

4. Pertimbangkan kebutuhan yield dan kemudahan workflow
   Second-generation system menggunakan lebih sedikit plasmid sehingga workflow-nya lebih sederhana dan ABMGood menyebutkan bahwa sistem ini cenderung memberikan yield lebih tinggi dibandingkan sistem generasi ke-3.
5. Pertimbangkan kebutuhan downstream
   Selain packaging mix, kebutuhan eksperimen dapat mencakup transfection reagent, viral titration, serta purification atau concentration. ABMGood menyediakan produk-produk tersebut sebagai produk individual maupun bundle untuk membantu menyederhanakan workflow.

Produk ABMGood untuk Lentivirus Packaging

Lentivirus packaging merupakan sistem terintegrasi yang melibatkan beberapa komponen dengan fungsi berbeda. Transfer plasmid membawa gene of interest, packaging plasmid menyediakan protein viral yang dibutuhkan untuk pembentukan partikel, sedangkan envelope plasmid menyediakan protein permukaan seperti VSV-G yang mendukung proses entry ke sel target.

Perbedaan utama antara sistem generasi ke-2 dan ke-3 terletak pada jumlah serta pemisahan plasmid packaging. Sistem generasi ke-2 menggunakan tiga plasmid dan menawarkan workflow yang lebih sederhana dengan kecenderungan yield lebih tinggi, sedangkan sistem generasi ke-3 menggunakan empat plasmid dengan pemisahan Rev dari Gag/Pol sehingga memberikan lapisan biosafety tambahan.

ABMGood menyediakan berbagai produk yang dapat mendukung workflow lentivirus, mulai dari packaging hingga titrasi dan purification.

Pemilihan produk sebaiknya disesuaikan dengan jenis transfer vector, kebutuhan biosafety, target yield, serta kebutuhan downstream dari penelitian. Dengan memahami fungsi setiap komponen, peneliti dapat memilih sistem lentivirus packaging yang lebih sesuai dengan kebutuhan eksperimennya.

Butuh bantuan memilih lentivirus packaging system, titration kit, atau produk purification yang sesuai dengan workflow penelitian?  Bapak/Ibu dapat menghubungi kontak yang tertera pada laman website Indogen berikut. Terima kasih.

Artikel Terkait

1. https://indogen.id/dari-sel-ke-organoid-membangun-model-3d-yang-lebih-relevan-untuk-penelitian-biomedis/
2. https://indogen.id/baca-artikel-ini-untuk-mengetahui-informasi-terkait-pelacakan-sel-dan-rna/
3. https://indogen.id/menjaga-kemurnian-biologics-strategi-pengelolaan-impurities-dan-peran-krusial-bioprocess-qc-assay-kit-dalam-industri-biofarmasi/