Antibodi monoklonal FACS, pelabelan fluoresen, dan produk Elabscience® dalam kategori Flow Cytometry dimaksudkan untuk membantu berbagai aplikasi laboratorium klinis dan penelitian untuk mendeteksi sel imun, sel darah dan jenis sel lainnya, serta status aktivasi sel secara efisien. Pemilihan produk yang paling sesuai untuk Flow Cytometry akan memudahkan penggunaan flow cytometry sebagai metode avant-gardist dari metode konvensional.

A. Tahapan Umum Flow Cytometry

1. Pengambilan sampel melibatkan pemilihan jaringan, sel, atau darah dan menyimpannya sesuai dengan jenis sampel.

2. Staining sel menggunakan antibodi fluoresen untuk mewarnai sel.

3. Memasukkan sampel ke dalam instrumentasi flowcytometer untuk deteksi dan pengumpulan data menggunakan software/program yang tersedia pada instrumen

4. Analisis data kuantitatif.

5. Evaluasi signifikansi biologis dan medis dari hasil analisis.

Tabel 1. Flow cytometers dari BioSino

Gambar 1. SinoCyte Flow Cytometer dari BioSino

B. Antibodi Flow Cytometry

Elabscience® menyediakan berbagai pilihan dye dan target protein intraseluler dan ekstraseluler untuk labelling sampel untuk pengujian Flow Cytometry. Antibodi monoklonal FACS dan teknologi pelabelan fluorescent, antibodi Flow Cytometry (FCM) dimaksudkan untuk membantu mengidentifikasi sel imun dan status aktivasi sel secara efisien. Pemilihan antibodi yang paling sesuai untuk Flow Cytometry dengan penelitian atau kegiatan diagnosis yang akan dilakukan.

Tabel 2. Panel antibodi FCM umum dan target sel deteksi

C. Staining Marker Permukaan

1. Penentuan jenis marker

Penanda permukaan sel: berdasarkan garis keturunan, tahap perkembangan, dan fungsi. Misalnya: penanda permukaan CD4 untuk sel T pembantu.

2. Sifat protein-protein

Marker: reseptor untuk ligan, saluran ion, glikoprotein, dll.

3. Seleksi antibodi dan reagen

Antibodi primer terkonjugasi fluorokrom, antibodi sekunder (jika antibodi primer tidak terkonjugasi), dan buffer pewarnaan.

D. Staining Marker Intraseluler

1. Marker: Proses seluler, seperti ekspresi protein, fosforilasi, dan produksi sitokin

2. Fiksasi: Larutan Fiksasi Jaringan / Paraformaldehyde 4% (dengan DEPC) (E-IR-R114), formaldehida atau aseton 0,01%

3. Permeabilisasi: 0,1–1% NP-40 atau metanol dingin

E. Buffer Spesifik

1. Protein Inti: Foxp3/Transcription Factor Staining Kit (E-AB-F1238C)

2. Protein yang disekresikan (Sitokin): Intracellular Fixation/Permeabilization Buffer Kit (E-CK-A109)

3. Protein Sinyal Terfosforilasi: Fiksasi/Protokol Metanol

F. Siklus Sel

1. Dye fluorescent atau fluorokrom untuk DNA: Propidium Iodide (PI) Solution(750 μM) (E-CK-A165) dan Cell Cycle Assay Kit (Red Fluorescence) (E-CK-A351)

2. Digunakan untuk mengukur jumlah DNA di setiap sel

3. Sel fase S lebih terang dari fase G1

4. Sel fase G2 dua kali lebih terang dari fase G1

5. Catatan: Dye fluorescent lainnya juga dapat digunakan, tetapi harus diperhatikan apakah dye tersebut bersifat permeabel untuk bereaksi dengan DNA. Sel mungkin perlu permeabilisasi dan/atau diperlakukan dengan RNase sebelum staining.

G. Apoptosis

1. DNA sel apoptosis bermigrasi sebagai ladder berukuran 180~200bp pada gel agarosa menghasilkan endonuklease teraktivasi yang memotong DNA genom di antara nukleosom menjadi fragmen-fragmen multimerik berukuran 180~200bp.

2. One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit dapat digunakan untuk mendeteksi apoptosis sel suspensi dan sel adheren dengan teknik flow cytometry.

3. Setelah fiksasi dan permeabilitas, 3′-OH dari DNA rusak dikatalisis oleh Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) dengan fluorescein berlabel dUTP dan dideteksi dengan flow cytometry.

Tabel 3. Kit flow cytometry untuk deteksi apoptosis dari Elabscience®

H.    Live/Death Cell

1. Calcein AM/PI Double Staining Kit (E-CK-A354) dapat membedakan sel mati dan sel viable pada mamalia melalui deteksi aktivitas esterase.

2. Calcein AM mampu meningkatkan hidrofobisitas sehingga dapat menembus membran sel hidup dan masuk ke dalam sel. Calcein AM tidak memiliki fluoresensi. Di dalam sel, Calcein AM dihidrolisis oleh esterase endogen untuk menghasilkan Calcein yang dapat berpendar hijau mencolok. Sel mati mempunyai esterase yang rendah, sehingga hanya sel hidup yang mempunyai fluoresensi hijau dengan intensitas tinggi, sedangkan sel mati tidak atau redup.

3. Permeabilitas selektif sel mati akan menghilang, sehingga Propidium Iodide (PI) dapat masuk dan berikatan dengan DNA menghasilkan fluoresensi merah dengan intensitas tinggi.

Gambar 2. Produk-produk flow cytometry dapat digunakan juga untuk immunofluorescence imaging

I. Proliferasi Sel

1. E-Click EdU Cell Proliferation Flow Cytometry Assay dapat digunakan untuk mendeteksi proliferasi sel dengan teknik flow cytometry.

2. Sintesis DNA: metode akurat untuk mendeteksi proliferasi sel.

3. Metode EdU: menggabungkan EdU dan reaksi klik, tanpa menggunakan antibodi, teknik relatif mudah dan sensitivitas tinggi.

4. EdU (5-ethynyl-2-deoxyuridine) (analog timidin) dapat menjadi alternatif pengganti timidin dalam sintesis DNA.

5. Gugus asetilen pada EdU bereaksi dengan probe azida fluoresen (FITC Azide, Elab Fluor® 488 Azide, Elab Fluor® 594 Azide, Elab Fluor® 647 Azide) melalui reaksi katalisis ion tembaga monovalen untuk membentuk cincin triazol yang stabil. Reaksi berlangsung sangat cepat sehingga disebut reaksi klik.

6. Sel yang melakukan proliferasi dapat dideteksi melalui fluoresensi.

Tabel 4. Kit flow cytometry untuk deteksi proliferasi sel dari Elabscience®

J. Referensi

https://www.elabscience.com/Products-flow_cytometry_antibodies-77.html

https://www.elabscience.com/Products-cell_proliferation_cytotoxicity_viability-159.html