Institute of Tropical Disease Universitas Airlangga rutin mengadakan Workshop setiap tahunnya. Kegiatan tersebut bertujuan agar peneliti kedokteran memiliki pemahaman terkait metode yang sering digunakan dalam penelitian bidang kedokteran. Sehingga, kegiatan ini dapat membantu peneliti untuk dapat melakukan uji laboratorium dengan tepat sesuai rancangan dan tujuan penelitian. Terlaksananya workshop ini, PT. INDOGEN INTERTAMA turut bergabung dalam kegiatan tersebut.

Gambar 1. Workshop Cultivate Consistency Cell Culture

A. Waktu dan Tempat Pelaksanaan Workshop Cultivate Consistency sel Culture

Tanggal : 13 November 2024
Tempat : Laboratorium Dengue Kampus C, Institute of Tropical Disease, Universitas Airlangga, Jalan Unair, Mulyorejo, Gubeng, Surabaya, Jawa Timur 60286

B. Penyampaian Materi

1.  sel Culture

Gambar 2. Penyampaian Materi oleh Dalli Mutiea, S.Si.

Poin penting dalam Kultur Sel antara lain:

• Pastikan jenis sel sesuai dengan riset yang dilakukan (menggunakan primary sel / sel line). Untuk lebih jelasnya terdapat pada link berikut ini https://indogen.id/perbedaan-sel-line-dan-sel-primer-sel-lines-vs-primary-sels/
• menggunakan medium yang sesuai dengan sel yang akan di kultur
• gunakan antibiotik untuk mencegah kontaminasi pada sel
• gunakan suplemen seperti serum yang mengandung faktor pertumbuhan sel, karena kandungan yang terdapat pada suplemen tidak terdapat pada basal medium
• sel dapat terkontaminasi oleh bakteri yang ditandai dengan adanya kekeruhan pada medium
• sel dapat terkontaminasi oleh fungi yang ditandai dengan adanya hifa pada medium pertumbuhan
• sel juga dapat terkontaminasi karena adanya cross contamination sehingga pengerjaan 1 sel lebih baik dikerjakan dalam 1 ruang
• sel dapat terkontaminasi oleh adanya nanobacteria yang ditandai dengan adanya bintik hitam
• sel dapat terkontaminasi oleh adanya mycoplasma yang harus dilihat melalui mikroskop

2.  Perkenalan Sel, Thawing dan Freezing Sel, Menghitung Jumlah Sel

1. Perkenalan sel
sel yang digunakan dalam kegiatan workshop adalah vero sel.

Gambar 3. Perkenalan sel

2. Thawing dan freezing sel

Peralatan yang digunakan dalam proses thawing yaitu

• 37°C, 5% CO2 incubator
• Safety cabinet or clean bench
• Centrifuge (with rotor for 15mL tube)
• Autopipetter
• WaterbathAdapun bahan yang digunakan dalam proses thawing yaitu

• Medium (MEM + 10% FBS, 1% L-Glutamine)
• 15 mL centrifuge tube
• Disposable pipette (5mL and 10mL)
• T-25 flask

Metode yang dilakukan dalam proses thawing yaitu

• Hangatkan medium dengan waterbath sampai mencapai suhu 37°C.
• Nyalakan dan sterilkan BSC dengan UV light selama 10 menit kemudian dengan ethanol 70%.
• Siapkan medium, autopipettor, T-25 Flask, dan wadah sampah di dalam BSC.
• Siapkan 10 ml medium di 15 ml tube dan 4 ml medium di flask T25.
• Ambil sel stok yang akan digunakan untuk recovery.
• Cairkan sel dengan panas tubuh (genggaman tangan).
• Setelah sel stok mencair, masukkan kedalam 10 ml medium di tube.
• Sentrifuge selama 5 menit 2000 rpm.
• Buang supernatant dan tambahkan 1 ml medium ke pellet.
• Pipet naik turun agar sel merata dan homogen.
• Masukan kedalam flask T25.
• Amati sel dengan mikroskop dan pastikan sel merata (tidak menggumpal).
• Tambahkan 2 ml medium.
• Letakkan sel kedalam inkubator 37°C, 5% CO2.

Medium yang digunakan pada workshop ini merupakan salah satu produk kami yaitu Elabscience Cat. PM150210 sel Culture Medium, Liquid DMEM (High Glucose). Adapun produk sel culture medium yang kami suplai yaitu sebagai berikut:

Gambar 4. Proses thawing

Peralatan yang digunakan dalam proses freezing sel, yaitu:

• 37°C, 5% CO2 incubator
• Safety cabinet or clean bench
• Centrifuge (with rotor for 15mL tube)
• Autopipetter
• Waterbath

Adapun bahan yang digunakan dalam proses freezing sel yaitu

• Medium (MEM + 10% FBS, 1% L-Glutamine)
• 0,025% Trpsine EDTA
• 15 mL centrifuge tube
• Disposable pipette (5mL and 10mL)
• T-25 flask

Metode yang dilakukan dalam proses freezing sel yaitu

• Ambil medium baru dari kulkas dan siapkan sebanyak 9 ml
• Tambahkan 1 ml DMSO dan campurkan hingga merata dengan membolak balikkan tube.
• Diamkan media dalam es.
• Ambil sel yang akan dipassage dan buang medium yang lama. Catatan: Gunakan sel yang 80% confluence atau lebih, jangan menggunakan sel yang over-growth.
• Bilas medium dengan 2 mL 0.025% Trypsine EDTA.
• Tambahkan 2 mL 0.025% Trypsine EDTA.
• Masukkan flask dalam inkubator 37oC sampai monolayer lepas menjadi sel tunggal ± 3 menit.
• Amati sel dengan mikroskop dan pastikan monolayer sudah menjadi sel tunggal.
• Tambahkan 2 ml medium.
• Pipet suspensi sel naik turun agar homogen.
• Hitung jumlah sel.
• Siapkan tube untuk penyimpanan sel.
• Ambil sel dan masukkan sejumlah ke tiap tube…..
• Letakkan sel kedalam freezer -80°C.

Medium yang digunakan untuk kultur dengan freezing merupakan medium yang berbeda. Brand Elabscience memberikan kemudahan untuk periset kultur sel dengan menyediakan freezing medium yaitu Elabscience Cat. PB180438 sel Culture Medium, Liquid Freezing Medium (Serum-free & animal origin-free). Adapun produk freezing medium yang dapat kami suplai antara lain:

3. Menghitung Jumlah Sel

Peralatan yang digunakan dalam proses menghitung  sel, yaitu:

• Haemocytometer
• Cover slip
• Counter
• Pipette
• 1 ml vial
• Mikroskop

Adapun bahan yang digunakan dalam proses menghitung  sel, yaitu:

• Sel Vero
• Medium (MEM + 10% FBS, 1% L-Glutamine)
• 4% Trypan blue stain

Metode yang dilakukan dalam proses menghitung sel yaitu:

• Pastikan haemocytometer dan coverslip bersih. Gunakan alkohol jika belum bersih.
• Pasang cover slip di haemocytometer.
• Siapkan suspensi sel dan campurkan dengan 0.4% trypan blue stain di vial dengan perbandingan 1:1. Contoh 100 μl sel dan 100 μl 0.4% trypan blue stain. Catatan: jika diperlukan sel dapat didilusi terlebih dahulu sebelum dicampur dengan 0.4% trypan blue stain.
• Pipet sel mix (± 10 μl) di tepi coverslip dan biarkan mengalir dibawah coverslip.
• Lihat haemocytometer grid di bawah mikroskop.
  

  Gambar 5: grid Haemocytometer dilihat dengan mikroskop. Empat kotak besar di pojok adalah lokasi untuk menghitung sel .

• Hitung sel yang hidup dan yang mati. Catatan: Sangat direkomendasikan untuk menghitung 40 – 70 sel untuk mendapatkan data yang akurat. Maka dari itu menghitung lebih dari satu kotak mungkin diperlukan. Cara menghitung sel dapat dilihat di gambar 6.
  

  Gambar 6: sistem perhitungan sel untuk memastikan akurasi dan konsistensi. Sel yang dihitung adalah sel yang terdapat di dalam kotak besar. Selain itu sel yang melewati batas di 2 dari 4 sisi kotak besar juga dihitung selama sel masih menyentuh garis 4 tengah. Contoh diatas menunjukkan bulatan-bulatan kecil adalah sel, warna hijau menandakan sel ikut dihitung dan warna merah berarti sel tidak dihitung

• Hitung konsentrasi sel dengan rumus berikut:
  

3.  Inokulasi Sel, Passage Sel, dan CPE

a. Inokulasi sel

Peralatan yang digunakan dalam proses inokulasi, yaitu:

• Autopipetter
• Culture plate ( 96 well plates)
• Micropipette
• Multichannel pipette
• 37°C, 5% CO2 incubator
• safety cabinet or clean bench
• Microscope

Adapun bahan yang digunakan dalam proses inokulasi, yaitu:

• Sample atau inokulum
• Medium (MEM + 10% FBS, 1% L-Glutamine)
• Sterilized tips (200μL and 10μL)
• Disposable pipettes (5 ml,10ml)

Metode yang dilakukan dalam proses inokulasi yaitu:

• Siapkan sel vero di 96 well plates.
• Masukkan sel kedalam inkubator 37°C, 5% CO2 sampai sel mencapai 80% confluence atau monolayer (± 1-2 hari).
• Untuk inokulasi primer maka siapkan dilusi spesimen 11x yaitu 5 μl dalam 60 μl medium per well. Untuk blind passage maka siapkan kultur lama yang akan di passage.
• Buang medium sel vero yang lama.
• Pindahkan 50 μl sample ke sel vero.
• Goyangkan plate dengan tangan agar campuran di plate merata.
• Inkubasi plate di 37°C, 5% CO2 selama 1 jam. Catatan: Goyangkan plate setiap 15 menit sekali.
• Tambahkan 50 μl medium baru.
• Inkubasi plate di 37°C, 5% CO2 selama 3-4 hari.
• Amati sel dibawah mikroskop setiap hari untuk mengetahui CPE.

b. Passage sel

Peralatan yang digunakan dalam proses passage sel, yaitu:

• 37°C, 5% CO2 incubator
• Safety cabinet or clean bench
• Centrifuge (with rotor for 15mL tube)
• Autopipetter
• Waterbath

Adapun bahan yang digunakan dalam proses inokulasi, yaitu:

• Medium (MEM + 10% FBS, 1% L-Glutamine)
• PBS
• 0,025% Trypsine EDTA
• 15 mL centrifuge tube
• Disposable pipette (5mL and 10mL)
• T-25 flask

Metode yang dilakukan dalam proses inokulasi yaitu:

• Hangatkan medium dengan waterbath sampai mencapai suhu 37°C.
• Ambil sel yang akan dipassage dan buang medium yang lama. Catatan: Gunakan sel yang 80% confluence atau lebih, jangan menggunakan sel yang over-growth.
• Bilas medium dengan 2 mL PBS.
• Tambahkan 2 mL 0.025% Trypsine EDTA.
• Masukkan flask dalam inkubator 37oC sampai monolayer lepas menjadi sel tunggal ± 2 menit.
• Amati sel dengan mikroskop dan pastikan monolayer sudah menjadi sel tunggal.
• Tambahkan 2 ml medium.
• Pipet suspensi sel naik turun agar homogen.
• Siapkan wadah baru untuk kultur.
• Ambil sel dan inokulasikan ke flask yang baru (vol medium disesuaikan dengan wadah baru (Tabel 1 ). Catatan: Ketika passage, jumlah sel dapat dihitung atau tidak
• Letakkan sel dalam inkubator 37°C, 5% CO2.

Tabel 1: Skema passage kultur sel.

Tripsin dalam kultur sel mamalia adherent berfungsi untuk bahan pendispersi sel yang menempel pada flask atau cawan kultur. Brand Elabscience menyediakan berbagai produk Trypsine yang dapat disesuaikan dengan riset dan kebutuhan. Berikut produk trypsin yang dapat kami suplai:

c. CPE

Efek sitopatik (cytopathic effect/CPE) merupakan kerusakan sel oleh virus berupa: degenerasi, nekrosis, sinsitium dan adanya sel raksasa. CPE dapat digunakan untuk mengetahui perkembangan virus dalam kultur sel. Pada workshop kali ini sel diinfeksikan dengan dengue virus.