Pendahuluan

Teknologi rekayasa genetika telah mengalami kemajuan pesat dalam beberapa dekade terakhir, terutama dengan kemunculan alat mutakhir seperti CRISPR dan cloning tools. CRISPR atau Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats memungkinkan modifikasi DNA secara presisi dan efisien, mengubah paradigma riset genetik dan terapi genetik (Doudna & Charpentier, 2014).

Awalnya, teknologi CRISPR merupakan bagian dari sistem imun adaptif yang ditemukan pada bakteri dan archaea. Sistem ini memungkinkan mikroorganisme tersebut mengenali dan melawan serangan virus dengan menyimpan fragmen DNA virus yang pernah menyerang di dalam urutan DNA berulang-ulang yang khas (Jinek dkk., 2012). Dengan kata lain, CRISPR berfungsi sebagai “memori genetik” yang membantu mengenali DNA asing dan melindungi diri dari infeksi di masa depan. Sistem ini bekerja bersama protein-protein khusus yang mampu mengenali dan memotong DNA asing tersebut. Pengembangan teknologi dari sistem CRISPR ini telah memberikan kemajuan besar dalam bioteknologi, terutama pada bidang penyuntingan genom, kloning gen, dan aplikasi klinis maupun agrikultural (Ran dkk., 2013). Prinsip dasar CRISPR melibatkan pengenalan urutan target DNA secara spesifik, sehingga memungkinkan modifikasi genetik yang presisi dan efisien.

Selain teknologi CRISPR, berbagai cloning tools juga memegang peranan penting dalam manipulasi DNA dan rekayasa genetika. Cloning tools memegang peranan penting dalam proses penggandaan DNA, yang menjadi dasar bagi berbagai aplikasi riset dan terapi genetik. Cloning tools, seperti enzim restriksi dan plasmid vektor, merupakan dasar penting dalam manipulasi genetik, memungkinkan penggandaan dan analisis gen tertentu (Sambrook & Russell, 2001).

Teknik kloning tradisional menggunakan enzim restriksi dan ligase untuk memotong dan menyambung fragmen DNA, sedangkan alat-alat modern kini telah berkembang untuk mempermudah dan mempercepat proses tersebut. Contohnya, teknologi Golden Gate cloning, Gateway cloning, dan Gibson assembly yang memungkinkan penggabungan fragmen DNA secara cepat dan efisien tanpa perlu enzim restriksi spesifik (Engler, Gruetzner, Kandzia, & Marillonnet, 2009; Gibson dkk., 2009).

Integrasi antara teknologi CRISPR dengan alat kloning canggih memungkinkan para peneliti untuk melakukan penyuntingan dan manipulasi gen dengan tingkat presisi yang tinggi, mendukung pengembangan terapi gen dan produksi organisme hasil rekayasa yang lebih cepat dan akurat (Zhang dkk., 2020).

Prinsip Dasar CRISPR

CRISPR adalah sistem pertahanan alami pada bakteri yang digunakan untuk mengenali dan memotong DNA asing, seperti virus. Sistem CRISPR-Cas9, yang dikembangkan untuk aplikasi rekayasa genetika, terdiri dari dua komponen utama: enzim Cas9 dan RNA panduan (sgRNA). Cas9 berfungsi sebagai pemotong DNA, sementara sgRNA mengarahkan Cas9 ke lokasi spesifik pada genom target.

Gambar 1. Penyuntingan gen menggunakan CRISPR-Cas9 (Gnudi dan Long, 2020)

Mulanya, Single guide RNA (sgRNA) dirancang untuk mengenali urutan spesifik pada DNA target. Kemudian, sgRNA akan berikatan dengan Cas9 dan mengarahkan enzim Cas9 ke lokasi target pada DNA. Proses editing dimulai dengan pengikatan sgRNA pada DNA target yang sesuai dengan urutan spesifik. Cas9 kemudian memotong kedua untai DNA pada lokasi tersebut, menghasilkan patahan ganda (double-strand break atau DSB). Selanjutnya, sel akan memperbaiki patahan ini melalui dua jalur utama yakni Non-Homologous End Joining (NHEJ), yang sering menghasilkan mutasi in-del, dan Homology-Directed Repair (HDR), yang memungkinkan penyisipan atau perbaikan urutan DNA yang lebih presisi. NHEJ dapat menyambungkan ujung DNA dengan cepat namun sering menghasilkan mutasi. Sedangkan HDR menggunakan template homolog untuk perbaikan DNA sehingga memungkinkan penyisipan atau perbaikan urutan DNA secara presisi.

Prinsip Dasar Cloning Tools

Dalam dunia rekayasa genetika, enzim restriksi sering digunakan untuk memotong DNA. Namun, metode ini memiliki keterbatasan penting: enzim tersebut tidak bisa memotong DNA di lokasi yang benar-benar spesifik, dan kadang memotong lebih dari satu titik dalam satu sekuens DNA. Sebagai solusi yang lebih presisi, para peneliti kini banyak menggunakan sistem CRISPR-Cas9, yang bekerja seperti “gunting molekuler pintar.” Dengan bantuan single guide RNA (sgRNA), Cas9 dapat diarahkan ke lokasi target tertentu di DNA, asalkan urutan tersebut berada sebelum PAM (Protospacer Adjacent Motif), yaitu sekuens 5′-NRG (R adalah A atau G). Ini membuat CRISPR mampu memotong DNA di hampir lokasi mana pun secara spesifik dan efisien (Wang dkk., 2014).

Menariknya, sebuah penelitian menunjukkan bahwa sistem ini bisa digunakan untuk memotong plasmid berukuran besar (22 kb) secara tepat di laboratorium. Setelah plasmid tersebut dipotong oleh Cas9, fragmen DNA baru disisipkan tanpa bekas (seamless) menggunakan metode Gibson Assembly, yaitu teknik kloning modern yang tidak memerlukan enzim restriksi tambahan. Kombinasi CRISPR dan Gibson Assembly ini membuka peluang baru untuk menyisipkan atau memodifikasi DNA dalam vektor besar yang sebelumnya sulit dimanipulasi dengan metode konvensional.

Gambar 2. Diagram skematik metode kloning CRISPR/Gibson (Wang dkk., 2014)

Ilustrasi di atas menggambarkan bagaimana sistem CRISPR/Cas9 dapat digunakan bersama metode Gibson Assembly untuk melakukan kloning DNA secara efisien dan tanpa bekas (seamless). Proses dimulai dengan sintesis single guide RNA (sgRNA) yang dirancang khusus untuk mengenali lokasi target pada plasmid. sgRNA ini kemudian memandu enzim Cas9 untuk memotong plasmid berukuran besar secara presisi, menghasilkan vektor linear. Pada saat yang sama, fragmen DNA yang akan disisipkan dipersiapkan melalui teknik PCR, dengan penambahan sekuens homolog (overhang) di ujung-ujungnya agar cocok dengan ujung plasmid yang telah dipotong.

Selanjutnya, proses Gibson Assembly digunakan untuk menyambungkan fragmen DNA ke dalam vektor. Enzim T5 exonuclease akan mengikis ujung 5′ DNA, menghasilkan ujung tunggal 3′ yang saling komplementer, memungkinkan proses annealing atau penempelan antar fragmen. Setelah itu, DNA polymerase mengisi celah antarfragmen, dan DNA ligase menyatukan semua bagian secara utuh melalui pembentukan ikatan fosfodiester. Hasil akhirnya adalah plasmid baru yang telah dimodifikasi secara spesifik, tanpa adanya sekuens tambahan atau bekas pemotongan. Kombinasi CRISPR dan Gibson Assembly ini menjadi solusi unggul untuk mengatasi keterbatasan metode kloning tradisional, terutama saat bekerja dengan vektor besar atau konstruksi genetik kompleks.

Selain Gibson Assembly, berikut adalah beberapa teknik kloning yang umum digunakan meliputi:

1. Restriction Enzyme Cloning
   Menggunakan enzim restriksi untuk memotong DNA pada lokasi spesifik, kemudian menyambungkannya ke vektor menggunakan ligase.
2. PCR-Based Cloning
   Menggunakan reaksi rantai polimerase (PCR) untuk mengamplifikasi fragmen DNA, yang kemudian dimasukkan ke dalam vektor.
3. Ligation-Independent Cloning (LIC)
   Teknik yang memungkinkan penyisipan DNA ke dalam vektor tanpa memerlukan enzim ligase, sering kali menggunakan homologi urutan untuk penyisipan.

Studi Kasus Produk OriGene

OriGene adalah perusahaan yang menyediakan berbagai produk untuk penelitian genetik, termasuk plasmid ekspresi, antibodi, dan kit CRISPR. Produk-produk mereka dirancang untuk memfasilitasi penelitian dalam bidang terapi gen, kanker, dan penyakit genetik lainnya. OriGene juga menyediakan jasa yakni CRISPR/Cas9 Gene Editing Cloning Services. Berikut adalah produk yang disediakan oleh brand OriGene.

1. CRISPR/Cas9 Genome Knockout Kits

Kit dari brand OriGene memiliki dua tipe yang berbeda sebagai berikut. Selain itu, juga terlampir berbagai jenis kit yang sudah divalidasi atau digunakan pada beberapa jenis sel line dan publikasi terkait penelitian tersebut.

2. CRISPR Vectors

3. CRISPRa and CRISPRi

4. Functional CAS9 Protein

5. Transgene Knockin via CRISPR at AAVS1 and ROSA26 Loci

Studi Kasus Produk Cyagen

Cyagen menawarkan layanan custom knock-out dan knock-in, khususnya untuk pembuatan model hewan transgenik yang relevan dengan studi penyakit. Mereka menyediakan berbagai layanan, termasuk pembuatan knock-out dan knock-in model, serta modifikasi genetik pada sel dan organoid.Penggunaan CRISPR dalam pembuatan model tikus transgenik telah mempercepat riset biomedis.

1. CRISPR Knockout Mice

Cyagen menyediakan layanan pembuatan model knockout menggunakan teknologi CRISPR/Cas9. Model knockout ini dibuat dengan menghilangkan gen tertentu pada tikus untuk mempelajari fungsi gen tersebut.

2. CRISPR Point Mutation Mice

Layanan berikutnya adalah pembuatan model tikus dengan mutasi titik (point mutation) pada gen target. Dengan teknologi CRISPR/Cas9, mutasi titik ini memungkinkan penyesuaian gen secara spesifik.

3. CRISPR Knockin Mice (ROSA26)

Cyagen juga menawarkan layanan pembuatan model knockin, terutama pada lokasi gen populer seperti ROSA26. Pada layanan ini, fragmen genetik hingga 15 kb dapat disisipkan pada lokus target, memungkinkan studi fungsi gen yang lebih kompleks.

4. CRISPR Conditional Knockout (cKO) Mice

Untuk kebutuhan penelitian yang lebih spesifik, Cyagen menyediakan layanan pembuatan model conditional knockout (cKO). Model ini memungkinkan penghapusan gen secara selektif di jaringan tertentu dengan sistem Cre-LoxP.

5. CRISPR Humanized Mouse Models

Terakhir, Cyagen menawarkan pembuatan model tikus humanized, yaitu tikus yang memiliki gen manusia disisipkan untuk studi penyakit yang lebih relevan dengan manusia.

Untuk pertanyaan produk dan stock lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kami PT. Indogen melalui email sales.indogen@gmail.com atau melalui WhatsApp berikut untuk fast respon +6281293185185.

Referensi :

Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2014). The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 346(6213), 1258096. https://doi.org/10.1126/science.1258096

Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., & Marillonnet, S. (2009). Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One, 4(5), e5553. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005553

Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., & Smith, H. O. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343–345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

Gnudi, L., Long, D. A., editors. (2020). Diabetic Nephropathy: Methods and Protocols. Humana. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9841-8_20

Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816–821. https://doi.org/10.1126/science.1225829

Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., & Zhang, F. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols, 8(11), 2281–2308. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.143

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Wang, J.-W., Wang, A., Li, K., Wang, B., Jin, S., Reiser, M., & Lockey, R. F. (2015). CRISPR/Cas9 nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning. BioTechniques, 58(4), 161–170. https://doi.org/10.2144/000114261

Zhang, L., et al. (2021). CRISPR-Cas9 mediated gene editing in cancer research. Cancer Research, 81(15), 4054-4062. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-20-3523

Zhang, Y., Malzahn, A. A., Sretenovic, S., & Qi, Y. (2020). The emerging and uncultivated potential of CRISPR technology in agriculture. Nature Plants, 6(8), 823–832. https://doi.org/10.1038/s41477-020-0697-1

Artikel Terkait

1. https://indogen.id/komponen-qpcr-dalam-genotyping-dan-metode-genotyping-pcr
2. https://indogen.id/prosedur-cloning-cdna-dan-viral-gene-delivery-dari-brand-origene/
3. https://indogen.id/cyagen/
4. https://indogen.id/riset-stem-cell-model-penyakit-dan-aplikasi-klinis/
5. https://indogen.id/cell-signaling-and-protein-biology/