Pendahuluan

Protein rekombinan didefinisikan sebagai protein spesifik yang diproduksi oleh organisme inang, biasanya mikroorganisme atau lini sel mamalia, yang telah direkayasa secara genetik untuk mengekspresikan gen yang mengkode protein target yang tidak akan diproduksi secara alami oleh organisme tersebut. Ekspresi protein rekombinan adalah proses mendasar dalam bioteknologi di mana organisme inang, biasanya mikroorganisme atau lini sel mamalia, direkayasa untuk menghasilkan protein spesifik yang diinginkan yang tidak akan diproduksinya secara alami. Proses ini melibatkan penyisipan gen yang mengkode protein target ke dalam genom organisme inang atau vektor ekspresi, yang kemudian diperbanyak dan diinduksi untuk mengekspresikan protein tersebut.

Ekspresi protein rekombinan merupakan alat dasar untuk biologi sel molekuler serta untuk berbagai bioteknologi, seperti rekayasa metabolik dan produksi protein rekombinan (protein terapeutik, vaksin, enzim industri, dll.). Namun, fokus produksi protein rekombinan adalah untuk mencapai titer, hasil, dan produktivitas yang tinggi guna mengurangi biaya produksi protein. Meskipun produksi protein rekombinan kini merupakan praktik yang stabil dan menjanjikan, produksi protein dalam skala besar masih menjadi tantangan ekonomi tersendiri, khususnya untuk aplikasi berbiaya rendah.

Produksi protein rekombinan dimulai dengan integrasi DNA rekombinan, seringkali dari sumber heterolog, ke dalam genom organisme inang di bawah kendali elemen ekspresi protein. Vektor DNA yang terdiri dari berbagai elemen genetik seperti gen yang diinginkan, promotor, terminator, reporter, penanda, dan enhancer ditransformasikan ke dalam sel inang menggunakan berbagai metode transformasi yang berbeda. Integrasi ke dalam genom sel inang juga dapat dicapai menggunakan berbagai mekanisme seperti pengeditan genom yang dimediasi CRISPR atau integrasi acak, dan sangat dipengaruhi oleh jenis sel inang (bakteri, tumbuhan, ragi, sistem kultur sel) dan spesies. Platform yang paling banyak digunakan meliputi bakteri ( Escherichia coli ), ragi ( Saccharomyces cerevisiae dan Pichia pastoris ), sel mamalia (sel CHO dan HEK-293), dan sel baculovirus/serangga (Sf9, Sf21).

Namun, protein dengan modifikasi pasca-translasi yang kompleks tidak dapat diproduksi dalam sistem bakteri atau ragi yang sangat produktif dan berbiaya rendah, dan oleh karena itu, sistem kultur sel yang mahal biasanya digunakan. Karena biayanya, sistem kultur sel biasanya hanya digunakan untuk menghasilkan produk bernilai tinggi seperti produk biologis. Dengan demikian, masih terdapat kesenjangan dalam sistem produksi yang tersedia untuk produksi protein eukariotik untuk aplikasi berbiaya rendah seperti enzim industri.

Prinsip Kerja Protein Rekombinan

Gambar 1. Ilustrasi workflow pada ekspresi protein rekombinan.

1. Kloning Dna, Strategi Perakitan Molekuler, dan Produksi Protein

Langkah pertama yang harus dilakukan adalah pemilihan gen yang mengkode protein yang dituju, vektor plasmid yang fitur-fiturnya sangat bergantung pada kebutuhan spesifik eksperimen, termasuk jenis organisme inang (misalnya, E. coli) dan ukuran DNA yang akan dimasukkan. Untuk ekspresi di E. coli, tingkat ekspresi gen yang diinginkan bergantung pada pilihan promotor yang sesuai. Pilihan-pilihan ini sangat mempengaruhi keberhasilan studi ekspresi gen. Plasmid tersebut dibangun melalui perakitan molekuler Gibson dari fragmen PCR yang dimurnikan. Keuntungan dari pendekatan ini adalah dimungkinkan, dengan serangkaian konstruksi lengkap yang tersedia di laboratorium atau diperoleh dari tempat lain, untuk memulihkan fragmen yang diinginkan dan menyusunnya dengan fragmen lain untuk membentuk plasmid yang diproduksi khusus yang mengekspresikan protein yang diinginkan dengan fase yang sama dengan tag atau protein fluoresen yang diinginkan.

2. Purifikasi Protein

Supernatan yang tersisa dari protokol sebelumnya kemudian dikenakan IMAC berkat tag 6×His. Langkah pencucian selanjutnya menghilangkan pengotor dan kemudian protein target dieluasi menggunakan buffer yang mengganggu interaksi pengikatan. Langkah pemurnian lebih lanjut dapat mencakup kromatografi eksklusi ukuran dan/atau kromatografi pertukaran ion untuk mencapai kemurnian yang lebih tinggi. Sepanjang protokol, konsentrasi protein dipantau dan kualitas dinilai menggunakan SDS-PAGE dan pewarnaan Coomassie blue yang cemerlang serta dengan western blot. Jika dilakukan dengan benar, POI murni akhir akan menunjukkan berat molekul yang diharapkan, kemurnian tinggi, dan aktivitas biologis.

3. Transduksi Protein di Sel Mamalia

Prosedur transduksi protein di dalam sel mamalia, contohnya Hep3B merupakan prosedur yang penting dalam rangkaian ini. Investigasi masuknya protein ke dalam sel mamalia merupakan aspek penting dalam biologi seluler dan molekuler, yang memberikan wawasan tentang proses fisiologis penting dan memungkinkan pengembangan strategi terapi yang ditargetkan. Protokol ini menggunakan pendekatan mendasar untuk transduksi protein ke dalam sel mamalia, suatu proses untuk secara efisien mengirimkan protein rekombinan eksogen. Lebih lanjut, nasib protein intraseluler yang ditransduksi dapat diamati melalui mikroskop imunofluoresens.

Dapat diketahui bahwa komponen kunci dalam proses ekspresi protein rekombinan adalah sebagai berikut:
A. Gen Target (DNA Sisipan): Urutan DNA spesifik yang menyandikan protein yang ingin diproduksi (misalnya, hormon insulin atau enzim tertentu.

1. Vektor Kloning/Ekspresi: Molekul DNA pembawa (biasanya plasmid) yang digunakan untuk menyisipkan gen target ke dalam sel inang. Vektor ini memastikan gen dapat diperbanyak dan diekspresikan
2. Elemen Regulasi Ekspresi: Komponen sekuens DNA yang mengatur kapan dan seberapa banyak protein diproduksi. Ini mencakup promotor (tempat awal transkripsi) dan terminator (tempat akhir transkripsi).
3. Organisme Inang (Host): Sistem biologis yang digunakan untuk membaca gen target dan memproduksi protein. Pilihan inang meliputi bakteri (seperti E. coli, ragi (yeast), sel serangga, atau sel mamalia)
4. Enzim (Restriksi & Ligase): Enzim restriksi berfungsi memotong DNA pada titik spesifik, sementara enzim ligase berfungsi menyambungkan gen target ke dalam vektor.

Berikut merupakan beberapa item yang dapat kami supply:

Tabel 1. Berbagai jenis item protein recombinant yang dapat disupply oleh PT Indogen Intertama

Berikut merupakan contoh daftar produk protein rekombinan yang dapat kami supply. Untuk informasi selanjutnya dan diskusi dapat menghubungi pada kontak berikut.

Source:
https://doi.org/10.1016/B978-0-323-98388-4.00011-3

https://www.mdpi.com/2674-0583/2/2/13

https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cpz1.1016