Penemuan DNA sebagai biomolekul pewarisan genetik dan penyakit membuka prospek terapi di mana gen mutan atau rusak dapat diubah untuk meningkatkan kondisi manusia. Kemampuan terkini untuk melakukan genetika manusia secara cepat dan terjangkau pada ratusan ribu orang, dan untuk mengurutkan genom lengkap, telah menghasilkan ledakan informasi urutan asam nukleat dan memungkinkan kita untuk mengidentifikasi gen, atau gen-gen, yang mungkin mendorong penyakit tertentu.

Adeno-associated virus (AAV) merupakan salah satu sarana terapi gen yang paling aktif diteliti. AAV terdiri atas selubung protein yang membungkus dan melindungi genom DNA untai tunggal berukuran kecil, yakni sekitar 4,8kb. AAV termasuk dalam famili parvovirus dan bergantung pada koinfeksi dengan virus lain untuk dapat bereplikasi, utamanya adalah adenovirus. Genom untai tunggalnya memuat tiga gen, yaitu Rep (Replikasi), Cap (Kapsid), dan aap (Perakitan). Ketiga gen ini menghasilkan setidaknya sembilan produk gen melalui penggunaan tiga promotor, situs awal translasi alternatif, dan penyambungan (splicing) diferensial.

Gen Rep mengkodekan 4 protein yang dibutuhkan untuk replikasi viral genome, yaitu Rep78, Rep68, Rep52 dan Rep40. Gen Cap mengekspresikan protein kapsid virus yang menjadi tameng utama virus, yaitu VP1/VP2/VP3. Kapsid virus juga terkait dengan binding terhadap sel inang dan juga internalisasi sel. Sedangkan gen aap mengkodekan assembly-activating protein (AAP) yang berfungsi sebagai kerangka untuk pembentukan kapsid.

Gambar 1. Struktur Kapsid AAV

Source: https://aavnergene.com/novel-aav-capsids/aav-capsid-structure/

Pemilihan Vektor

Aspek utama yang perlu dipertimbangkan dalam desain rasional vektor rAAV adalah ukuran pengemasan kaset ekspresi yang akan ditempatkan di antara kedua ITR. Awalnya disepakati bahwa ukuran di bawah 5 kb (termasuk ITR virus) sudah memadai. Upaya untuk menghasilkan vektor rAAV dengan kaset pengemasan melebihi 5 kb mengakibatkan penurunan signifikan dalam hasil produksi virus atau terjadinya rekombinasi transgenik. Meskipun awal mula ekspresinya berlangsung secara cepat, pada beberapa kasus kapasitas kaset vektor ini perlu untuk dikurangi menjadi sekitar 3,3 kb.

AAV2 merupakan salah satu serotipe AAV pertama yang diidentifikasi dan dikarakterisasi, termasuk urutan genomnya. Berkat pemahaman mendalam mengenai biologi AAV2 yang diperoleh dari penelitian awal tersebut, sebagian besar vektor rAAV yang diproduksi saat ini menggunakan ITR AAV2 dalam desain vektornya. Urutan yang ditempatkan di antara ITR tersebut biasanya mencakup promotor mamalia, gen target, dan terminator. Contoh promotor jenis ini yang umum digunakan meliputi promotor/enhancer CMV (cytomegalovirus), EF1a (elongation factor 1a), SV40 (simian virus 40), β-actin ayam, dan CAG (CMV, β-actin ayam, β-globin kelinci). Semua promotor tersebut menghasilkan ekspresi gen tingkat tinggi yang aktif secara konstitutif pada sebagian besar jenis sel. Namun, beberapa promotor ini dapat mengalami pembungkaman (silencing) pada jenis sel tertentu, sehingga aspek ini perlu dipertimbangkan untuk setiap aplikasi.

Seleksi dan Optimasi Kapsid AAV

AAV memasuki sel melalui interaksi awal dengan karbohidrat yang terdapat pada permukaan sel target, yang umumnya berupa asam sialat, galaktosa, dan heparin sulfat. Perbedaan halus dalam preferensi pengikatan gula dapat mempengaruhi preferensi transduksi berbagai varian AAV terhadap jenis sel tertentu. Pengikatan karbohidrat ini ditentukan oleh perbedaan urutan kapsid. Sebagai contoh, AAV9 memiliki preferensi untuk berikatan dengan sel melalui galaktosa akibat perbedaan asam amino yang unik pada urutan kapsidnya. Selain karbohidrat utama, reseptor sekunder juga berperan dalam induksi awal virus, seperti AAV2 menggunakan integrin αVβ5 and α5β1, AAV6 menggunakan reseptor growth factor dan AAV5 menggunakan reseptor platelet-derived growth factor. Beberapa studi terakhir juga bahwa AAVR diidentifikasi menjadi reseptor kritis untuk internalisasi dan binding sel.

Berikut merupakan informasi vektor AAV dan juga reseptornya disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Vektor AAV yang telah terseleksi, reseptor dan tropismenya

Keterangan: AAV: adeno-associated virus; EGFR: epidermal growth factor receptor; FGFR: fibroblast growth factor receptor: G: galactose; H: heart; HGFR: hepatocyte growth factor receptor; HS: heparan sulfate: Lg: lung; LR: laminin receptor; Lv: liver; N: neuronal; P: pancreas; PDGFR: platelet-derived growth factor receptor; PR: photoreceptors; RPE: retinal pigmented epithelia; SA: sialic acid; Sk: skeletal muscle.

Pemilihan jenis AAV tertentu sebagai vektor transfer gen sangat bergantung pada beberapa kriteria krusial seperti berikut:

1. jenis sel atau jaringan yang menjadi target;
2. profil keamanan terkait gen yang dihantarkan;
3. pilihan metode penghantaran, baik secara sistemik maupun lokal;
4. penggunaan promotor yang spesifik terhadap jaringan atau yang aktif secara konstitutif.

Manufaktur AAV untuk Penggunaan Klinis

Seperti kebanyakan bioterapi, AAV perlu diproduksi dalam sistem hidup. Berikut merupakan ilustrasi prosedur manufaktur AAV untuk penggunaan klinis.

Gambar 2. Gambaran umum produksi/pemurnian AAV

1. Cell Platform: Cell platform yang digunakan biasanya adalah HEK-293T, Sf9, atau sel lain yang sesuai. Sel kemudian ditransfeksi dengan virus pembantu adenovirus, serta plasmid rep/cap dan ITR-transgen (untuk sel 293T), atau diinfeksi dengan bakulovirus (untuk sel Sf9). Cell Line produsen yang memiliki ekspresi terintegrasi dari rep/cap dan ITR-transgen dapat diinfeksi dengan adenovirus dan dikultur dalam skala besar.
2. Scale up: Untuk volume kultur yang lebih besar, virus dapat diproduksi menggunakan roller bottle, sistem perfusi kontinu, atau bioreaktor WAVE.
3. Purification: Kromatografi afinitas atau heparin merupakan metode optimal untuk mengisolasi virus dari supernatan kultur, baik dengan pemanenan pelet sel maupun tidak. Perlakuan menggunakan Benzonase/DNase terhadap virus hasil elusi diperlukan untuk menghilangkan kontaminasi DNA di luar virus (extraviral), diikuti dengan kromatografi pertukaran anion untuk memisahkan fraksi partikel AAV ‘kosong’ (empty) dan ‘penuh’ (full).
4. QC/Rilis: 3 protein yang ditunjukkan pada gambar merupakan VP1, VP2 dan VP3 dari AAV. Analisis AAV1 menggunakan dynamic light scattering dan menunjukkan hasil seragam, yakni sekitar 25–30 nm. Ultrasentrifugasi analitik dapat menentukan proporsi partikel ‘kosong’ versus ‘penuh’ dari materi yang telah dimurnikan. Uji tambahan yang sebaiknya dilakukan meliputi digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) untuk menentukan titer dalam satuan GC/mL, mikroskopi elektron transmisi atau cryo-EM untuk visualisasi partikel murni, pengujian endotoksin, serta uji lainnya untuk mengevaluasi keberadaan kontaminasi residu protein sel inang.

Strategi Delivery AAV untuk terapi

1. Delivery sistemik: beberapa uji klinis yang menggunakan metode pemberian secara sistemik untuk menargetkan liver. Liver dipilih karena merupakan sebuah jaringan yang mudah dijangkau melalui jalur pemberian sistemik dan mudah ditransduksi oleh berbagai varian AAV yang karakteristiknya telah diketahui. Uji klinis tersebut sebagian besar ditujukan untuk penyakit genetik monogenik, dengan tujuan mengganti gen yang rusak, termasuk gen yang mengalami mutasi pada hemofilia A dan B.
2. Delivery intramuskular: Otot rangka telah terbukti menjadi jenis jaringan target yang dapat ditransduksi secara efisien oleh banyak varian AAV. Setelah ditransduksi, sel-sel otot berfungsi sebagai tempat produksi protein yang dapat bekerja secara lokal maupun sistemik. Akibat rendahnya laju pergantian sel otot, produk gen AAV hasil transduksi akan bertahan di dalam sel-sel tersebut sebagai episom selama bertahun-tahun, seperti yang telah ditunjukkan dalam berbagai penelitian pada primata.
3. Delivery Sistem Saraf Pusat: Pemberian langsung ke sistem saraf pusat kini diterapkan untuk penyakit Parkinson serta berbagai penyakit turunan seperti penyakit Batten, penyakit Canavan, dan mukopolisakaridosis (MPS) IIA dan IIB, serta MPS IIIa dan MPS IIIb. Studi untuk penyakit-penyakit ini menggunakan beragam varian AAV seperti AAV2, AAVrh10, dan AAV9. Strategi delivery mencakup pemberian langsung secara intraparenkim ke area otak tertentu, serta melalui jalur intraserebroventrikular, sisternal, dan intratekal lumbal. Keputusan mengenai jalur pemberian terbaik sangat bergantung pada jenis penyakit dan area otak yang terdampak. Sebagai contoh, untuk penyakit Parkinson, berdasarkan pemahaman terkini mengenai patogenesis penyakit dan strategi terapeutik, injeksi langsung ke dalam putamen, substantia nigra, atau striatum dianggap diperlukan. Demikian pula, untuk penyakit yang memengaruhi area otak yang lebih luas, seperti penyakit Canavan atau MPS, injeksi langsung dilakukan ke dalam serebelum.

Produk Riset AAV

Berikut kami sertakan pada artikel ini beberapa produk terkait riset untuk AAV dari ABM Good yang dapat kami supply.

Tabel 2. Item riset terkait AAV

Berikut merupakan sekilas informasi yang dapat kami sampaikan terkait AAV. Apabila terdapat kebutuhan dan ingin berdiskusi lebih lanjut dapat menghubungi kami pada kontak berikut. Terimakasih dan sampai jumpa di artikel selanjutnya!

Source:

1. https://docs.google.com/document/d/1jLzI6g5adGG9srekjSP3cK3N4kEHzqEA34ZzU83Wcmk/edit?tab=t.0
2. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12268253/
3. https://aavnergene.com/novel-aav-capsids/aav-capsid-structure/