I. Pendahuluan

Pada tanggal 14-16 Oktober 2026, PT Indogen Intertama kembali membuktikan peran nyata terhadap kemajuan dunia science dengan sekali lagi menggelar workshop yang berkolaborasi dengan Laboratorium Riset Translasional Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran. Sebelum dilaksanakan workshop, terlebih dahulu  kami melakukan Webinar free pada hari Jumat, 9 Oktober 2026 sebagai pembuka rangkaian acara ini. Webinar dan Workshop kali ini mengusung topik Flow Cytometry yang banyak memberikan terobosan untuk riset utamanya terkait protein dan sel.

Pengembangan agen terapeutik berbasis bahan alam maupun kemoterapi membutuhkan evaluasi mendalam terhadap regulasi proliferasi dan mekanisme kematian sel untuk memastikan efikasi serta potensi farmakologisnya. Uji respons seluler melalui pemetaan tingkat kelangsungan bidup (survival rate) menjadi krusial untuk mengevaluasi interaksi sinergis dalam menghambat pertumbuhan sel target. Sehingga workshop kali ini dilaksanakan dengan tujuan untuk mendalami dan mengevaluasi bahan alam dengan menilai survival rate yang diperiksa oleh flow cytometer.

Workshop ini akan menyajikan dua pengujian berbeda didalamnya, yaitu pengujian untuk Apoptosis dan juga Cell Cycle yang menggunakan MCF-7 Cell Line. Pengujian apoptosis pada workshop ini menggunakan kit E-CK-A211 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit, sedangkan untuk pengujian Cell Cycle menggunakan E-CK-A351 Cell Cycle Assay Kit (Red Fluorescence).

Acara ini dilangsungkan selama tiga hari dengan rangkaian sebagai berikut:

Rangkaian kegiatan ini memberikan penjelasan secara menyeluruh terkait prinsip, metode dan aplikasi flow cytometry untuk pengujian apoptosis dan cell cycle. Prinsip penggunaan flow cytometery pada dasarnya dapat digunakan untuk mengukur berbagai aplikasi seperti Apoptosis dan Nekrosis, Cell Cycle, Immunophenotyping dan Cytokine.

Workshop dilakukan dengan arahan penuh dari tim Laboran dari Laboratorium Riset Translasional Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran. Selama rangkaian workshop, para peserta diberikan materi dasar terkait instrumen flowcytometer, dasar dan prinsip kultur sel MCF-7 dan teori serta aplikasi uji apoptosis dan siklus sel. Diskusi dilakukan dengan proaktif dengan peserta yang saling bertukar ilmu dan experience terkait riset-riset yang telah dilakukan, yang sedang berlangsung dan yang akan dilakukan di masa mendatang.

II. Rangkaian Kegiatan Workshop

Materi dan Diskusi: Prinsip Dasar flow cytometry

Flowcytometry diambil dari kata Flow, Cyto dan Meter yang dapat diartikan sebagai metode untuk mengukur/menganalisa berbagai parameter suatu single cell dari suatu populasi sel heterogen secara simultan melalui suatu aliran fluidic. 3 sistem utama yang dimiliki dalam sistem flowcytometer adalah sistem fluidik, sistem optik dan sistem elektronik.

Sistem fluidik berfungsi untuk mengangkut partikel sample kedalam aliran ke sinar laser untuk proses interogasi. Partikel akan dialirkan melalui saluran yang nantinya akan dipaparkan oleh sinar laser dan dihamburkan. Forward scatter (FSC) dan side scatter (SSC) masing-masing memberikan informasi tentang ukuran dan kompleksitas sel. Misalnya, sel mati biasanya memiliki FSC lebih rendah daripada sel hidup. Neutrofil lebih granular daripada leukosit sehingga memiliki SSC yang lebih tinggi. Jika sel mengekspresikan protein fluoresen atau diwarnai dengan antibodi terkonjugasi fluorokrom, molekul fluoresen dieksitasi dan memancarkan sinar dengan panjang gelombang (warna) tertentu.

Sistem optik terdiri dari optik eksitasi dan optik koleksi. Optik eksitasi terdiri dari laser berwarna dan juga lensa prisma yang disusun tidak beraturan sehingga dapat cahaya dapat dihamburkan yang kemudian difokuskan kembali. Sedangkan optik koleksi terdiri dari berbagai detektor warna yang berfungsi untuk mengoleksi data warna yang dieksitasikan oleh lensa optik.

Sistem elektronik akan mengumpulkan dan memproses informasi sinyal-sinyal tegangan yang diterima dari sistem optik. Data berupa tinggi, lebar, dan luas pulsa elektronik (tegangan) ditentukan oleh ukuran, kecepatan, dan intensitas fluoresensi sel. Informasi lebih detail terkait prinsip dasar flowcytometer sebelumnya telah kami ulas dan dapat diakses pada link berikut.

Prinsip dasar Apoptosis dan Siklus Sel

Apoptosis adalah kematian sel terprogram yang yang diatur oleh genetik yang terjadi secara alami dalam tubuh. Apoptosis ini berperan penting dalam homeostasis jaringan dan respons terhadap agen kemoterapeutik maupun radiofarmaka terapeutik. Salah satu penanda awalnya yaitu translokasi fosfatidilserin (PS) dari lapisan dalam (inner leaflet) ke lapisan luar (outer leaflet) membran plasma, sebelum integritas membran hilang. Pada sel sehat, PS berada di bagian dalam dinding sel. Saat terjadi apoptosis, PS akan keluar dari dalam dinding sel, dan memberikan sinyal “eat me” pada sel fagosit untuk menghancurkannya. Annexin V adalah protein +35-36 kDa yang mengikat PS dengan afinitas tinggi hanya bila ada Ca2+ yang ada dalam binding buffer. Larutan ber-EDTA harus dihindari sebelum pewarnaan karena dapat mengikat calcium. Propidium lodida (PI) merupakan zat warna yang tidak bisa masuk ke dalam sel sehat, PI bisa masuk dan mewamai DNA dalam inti sel jika dinding sel sudah rusak parah. Informasi terkait apoptosis dan kematian sel lainnya dapat diakses pada link berikut.

Siklus sel terdiri atas fase GO (istirahat), G1 (gap pertama). S (sintesis DNA), dan G2/M (gap kedua/mitosis). Sel G0/G1 memiliki DNA diploid (2N), sel G2/M memiliki DNA tetraploid (4N), dan sel fase S memiliki DNA di antara 2N dan 4N. PI berinterkalasi secara stoikiometrik ke DNA untai ganda, sehingga intensitas fluoresensinya sebanding dengan kandungan DNA. Membran sel dipermeabilisasi dengan fiksasi etanol dingin agar PI dapat masuk ke semua sel. PI juga mengikat RNA untai ganda. RNase A mendegradasi RNA sehingga histogram hanya mencerminkan DNA.

Prosedur Kerja

Siapkan sel MCF-7 dengan konfluensi 80-90%. Buang medium yang digunakan untuk pertumbuhan sel, kemudian cuci dengan PBS 1x sebanyak 2mL, 2 kali. Pencucian ini untuk memastikan bahwa sudah tidak ada lagi protein dari medium yang berasal dari FBS yang tertinggal diatas permukaan sel. Protein (FBS) yang tertinggal akan mengganggu kerja tripsin untuk detach sel dari permukaan flask. Setelah dirasa medium sudah bersih, tambahkan tripsin 1x sebanyak 1-1,5 mL dan inkubasi selama 3-5 menit untuk detach sel dari flask. Kemudian hitung jumlah sel dengan metode haemocytometer dan tripan blue. Setelah cell terhitung, hal yang dilakukan selanjutnya adalah menghitung seeding sel yang digunakan untuk uji.

Siapkan stock seeding cell dan juga dish yang digunakan untuk uji. Jumlah dish disesuaikan dengan kebutuhan uji. Pada workshop ini digunakan dish berdiameter 6cm dan dibuatkan 3x pengulangan untuk tiap tiap perlakuan. Setelah seluruh kebutuhan telah disiapkan, pindahkan sel dari tube stock seeding kedalam dish hingga seluruh dish terisi oleh sel. Inkubasi sel selama 24 jam sebelum dilakukan pemeriksaan lainnya dan pastikan konfluensi sel sekitar 80%.

Buat larutan uji berdasarkan hasil pengujian viabilitas sel, buatkan sejumlah volume untuk 3x pengulangan pengujian. Misal: a) Sampel ekstrak pada konsentrasi IC 50, b) Kontrol positif cisplatin pada konsentrasi IC 50, c) Kontrol pelarut (DMSO), d) Kontrol sel. Buang medium lama pada sel sehingga menyisakan sel yang tumbuh pada dasar plate. Ganti dengan medium baru yang mengandung larutan uji. Inkubasi dalam inkubator sesuai dengan waktu pengujian yang dikehendaki (contoh : 24 jam, 48 jam, atau 72 jam)

Setelah masa inkubasi berakhir, dilakukan pemanenan sel. Pemanenan sel dilakukan persis seperti proses detachment sel pada langkah sebelumnya, namun medium dan larutan PBS yang digunakan dikumpulkan seluruhnya pada tube falcon 15ml. Sentrifugasi sel tersebut dengan kecepatan 3000rpm selama 5 menit, kemudian buang supernatan. Siapkan tabung microtube 1,5 mL dan beri label sesuai dengan jumlah perlakuan dengan 3x pengulangan. Perlakuan tersebut adalah sebagai berikut: untuk Kontrol sel dibagi menjadi 4 tube dengan keterangan masing-masing sebagai berikut: Kontrol Unstain, Kontrol Annexin, Kontrol PI dan Kontrol Annexin-PI; Kontrol pelarut (DMSO); Kontrol Positif (Cisplatin) dan Sampel uji (ekstrak).

Uji Apoptosis

Pengujian Apoptosis menggunakan prosedur yang disediakan oleh Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit dari Elabscience dengan nomor katalog E-CK-A211. Langkah pertama yang dilakukan adalah siapkan annexin V binding 1x. Resuspensi pelet yang telah dimiliki dalam 500 µL Binding Buffer 1x, kemudian pipet perlahan sebanyak 5-10x. Tambahkan 5µL Annexin V-FITC dan/atau 5µL PI sesuai desain awal tabung. Vortex perlahan lalu inkubasi selama 20 menit pada ruang gelap.

Running tiap tabung microtube (perlakuan) pada alat flowcytometer dengan pengaturan sebagai berikut: a) pasang tabung sampel pada sample injection port, b) atur flow pada kecepatan medium dengan jumlah event 10,000 event pada software program, c) jalankan operasi tiap-tiap sampel secara berurutan dengan lakukan pencucian pada port tiap berganti sampel perlakuan untuk membersihkan sisa-sisa larutan sebelumnya yang menempel pada alat/port, d) simpan data mentah tiap sampel untuk dokumentasi.

Analisis dan Gating Apoptosis dilakukan dengan langkah sebagai berikut:
1. Plot Dot Plot FSC-A vs SSC-A: buat gate polygon /rectangular (mis. “P1”) untuk menemule populasi utama dan memisahkan dengan debris

2. Plot Dot Plot FSC-A vs FSC-H dari populasi P1, buat gate “P2” (singlet gate) di sepanjang garis diagonal linier.

3. Dari populasi singlet (P2), buat Dot Plot FL1-A (Annexin V-FITC) vs FL2-A (PI) menggunakan skala logaritmik pada kedua sumbu

4. Terapkan Quadrant dan lakukan pengaturan kompensasi pada plot FLI vs FL2 dengan garis batas (threshold) ditentukan berdasarkan sampel unstained control dan dikonfirmasi dengan compel single-stain (control sel yang diwarnai dengan P1 saja den Anexin saja).

5. Kuadran yang terbentuk akan menunjukan hasil sebagai berikut.

Uji Cell Cycle

Pengujian Siklus Sel yang dilakukan pada workshop kali ini menggunakan prosedur manual pada Elabscience E-CK-A351 Cell Cycle Assay Kit (Red Fluorescence) yang menggunakan staning PI. Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan larutan etanol absolut bersuhu dingin (-20 ℃) yang telah disiapkan satu hari sebelumnya. Lalu lakukan prosedur seperti pada poin c. Resuspensi pelet dengan 0.3ml PBS hingga menjadi suspensi sel tunggal. Vortex secara perlahan dan secara berkala masukkan 1,2 mL etanol dingin yang telah disiapkan. Penambahan etanol pada proses ini adalah untuk membuka membran sel sehingga pewarna PI dapat mewarnai nukleus sel. Lalu tutup rapat tubes dan simpan pada suhu -20 ℃ selama satu jam.

Sentrifugasi sel dengan kecepatan 3000rpm selama 5 menit, lalu buang seluruh etanol pada tube. Resuspensi sel dengan 1,5 mL PBS lalu diamkan selama 15 menit pada suhu ruang. Langkah ini dilakukan untuk menarik sisa-sisa etanol yang tersisa di dalam sel. Sentrifugasi kembali, lalu bung supernatan hingga bersih. Tambahkan RNAse A Reagent yang disediakan pada kit sebanyak 100µl, resuspensi dan inkubasi dalam dry bath 37 ℃ selama 30 menit. Tambahkan 400µl PI Reagent, homogenkan secara merata lalu inkubasi kembali selama 30 menit pada suhu 2-8 ℃. Kemudian lakukan running pada flowcytometer sama dengan poin sebelumnya dengan tambahan ketentuan sebagai berikut: Siapkan template eksperimen dengan plot: (a) dot plot FSC-H vs SSC-H, (b) dot plot FL2-A vs FL2-H untuk diskriminasi doublet, dan (c) histogram Count vs FL2-A untuk analisis DNA.

Analisis dan Gating Siklus Sel:

1. Plot Dot Plot FSC-A vs SSC-A: buat gate polygon/rectangular (mis. “P1”) untuk menentukan populasi utama dan memisahkan dengan debris

2. Plot dot plot baru FL2-A (sumbu-x) vs FL2-H (sumbu-y) dari sinyal P1. Buat gate “P2” (singlet gate) di sepanjang garis diagonal linier.

3. Terapkan gate P2 (singlet) pada histogram Count vs FL2-A. Histogram yang dihasilkan idealnya menunjukkan dua puncak utama serta area antar-puncak sebagai berikut:

4. Lakukan analisis pada seluruh kelompok (kontrol negatif, perlakuan, kontrol positif) menggunakan pengaturan gate dan region yang identik untuk memastikan komparabilitas antar-sampel.

5. Ekspor hasil persentase %sub-G1, %GO/G1, %S, dan %G2/M dari setiap sampel/ulangan ke dalam tabel rekapitulasi untuk analisis statistik lanjutan.

6. Pada tab Statistics, BD Accuri C6 Software menampilkan jumlah event dan persentase (%) sel pada setiap gate/kuadran secara otomatis dalam bentuk master table, yang dapat disalin langsung ke spreadsheet (Excel) dan gambar dapat di ekspor ke ppt (power point).

Berikut merupakan informasi yang dapat kami sampaikan terkait kegiatan workshop flowcytometry dengan pengujian apoptosis dan siklus sel. Apabila terdapat pertanyaan dan hal yang ingin didiskusikan dapat menghubungi kami pada kontak berikut.

Sampai bertemu di ulasan workshop lainnya.

Source:
https://www.elabscience.com/p/annexin-v-fitc-pi-apoptosis-kit–e-ck-a211

https://www.elabscience.com/p/cell-cycle-assay-kit-red-fluorescence–e-ck-a351

Instruksi Kerja Uji Viabilitas sel MCF-7 – Laboratorium Riset Translasional Farmasi UNPAD.