A. Prinsip Dasar Chromatographic Fractionation

Prosedur kromatografi merupakan teknik yang paling beragam dan luas digunakan dalam fraksinasi ekstrak. Semua kromatografi bergantung pada distribusi diferensial senyawa antara dua fase, di mana salah satunya bergerak relatif terhadap yang lain. Kedua fase ini disebut dengan fase gerak dan fase diam. Fase gerak adalah fluida yang berupa cairan, gas, atau fluida superkritis. Adapun fase diam yang digunakan biasanya berupa bahan padat yang terdiri dari partikel-partikel halus yang terdapat dalam kolom. Pemisahan dapat didasarkan pada adsorpsi, distribusi massa, pertukaran ion, atau berdasar perbedaan sifat fisikokimia molekul seperti ukuran, massa, volume, dan sebagainya.

B. Ion Exchange Chromatography (IEXC)

Interaksi ionik merupakan dasar pemurnian protein melalui kromatografi pertukaran ion. Pemisahan ini dapat terjadi akibat dari persaingan antara protein dengan muatan permukaan yang berbeda untuk kelompok bermuatan berlawanan pada adsorben penukaran ion. Interaksi antara protein dan penukar ion tidak hanya bergantung pada muatan bersih dan kekuatan ionik, tetapi juga pada distribusi muatan permukaan protein. Jika terdapat daerah permukaan dengan konsentrasi gugus bermuatan yang tinggi pada protein, ikatan dapat terjadi bahkan ketika muatan total protein tersebut nol. Fenomena ini ditunjukkan oleh enzim fosfogliserat kinase yang mengikat penukar kation pada pH tertentu ketika muatan bersihnya sedikit negatif. Selain itu, karena kromatografi bergantung pada konformasi protein, beberapa perubahan struktural dapat mempengaruhi pemisahan melalui IEXC.

Fase Diam pada IEXC

Penukar ion kuat memiliki gugus fungsional (sulfonat dan amonium kuaterner) dengan pH 4-10, tidak akan mengubah muatan penukar ion tersebut. Sebaliknya, penukar ion lemah memiliki gugus fungsional ionik (karboksilat dan dietil amonium) dengan pH terbatas untuk penggunaannya. Sehingga, protein yang sulit terionisasi dapat dipisahkan menggunakan penukar ion kuat. Adapun untuk protein yang bermuatan lebih tinggi, penukar ion lemah memiliki keunggulan karena sejumlah alasan, termasuk kecenderungan yang lebih rendah terhadap denaturasi sampel, ketidakmampuannya untuk mengikat kontaminan bermuatan lemah, serta resolusi elusi yang lebih baik.

Fase Gerak pada IEXC

Nilai pH dan konduktivitas buffer sangat penting karena tingkat adsorpsi ditentukan oleh faktor-faktor tersebut. Konduktivitas rendah dan nilai pH yang memberikan muatan optimal pada protein harus dipilih. Pemilihan ion penyangga juga mempengaruhi pemisahan. Misalnya, tarikan elektrostatik antara dua gugus bermuatan berlawanan lebih tinggi dalam lingkungan hidrofobik. Buffer seperti amonium asetat dapat meningkatkan resolusi untuk beberapa kasus. Buffer tersebut memiliki keunggulan karena sifatnya yang mudah menguap sehingga mudah dihilangkan melalui liofilisasi.

Keunggulan:

1. Elusi berlangsung dalam kondisi ringan, sehingga protein dapat mempertahankan konformasi aslinya selama proses kromatografi.
2. Penukar ion memiliki substitusi yang lebih padat dibanding adsorben lain.
3. Spesifitas yang luas memungkinkan proses penghilangan kontaminan dapat signifikan.
4. Resin penukar ion bersifat sangat kuat dan dapat disterilkan di tempat serta dapat digunakan untuk ratusan siklus.

Kelemahan:

1. Keterbatasan selektivitas

C. Chromatographic Methods Based on Hydrophobicity

Protein dapat dipisahkan berdasarkan perbedaan hidrofobisitasnya dengan 2 metode, yaitu:

1. Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)

HIC didasarkan pada interaksi reversibel antara permukaan protein dan sorben kromatografi yang sifatnya hidrofobik. Protein-protein tersebut akan dipisahkan berdasar perbedaan jumlah asam amino hidrofobik yang terdeteksi. Adanya interaksi hidrofobik, campuran protein yang dimuat dalam kolom berisi buffer dengan konsentrasi garam yang tinggi.

Fase Diam HIC

Banyak jenis matriks yang cocok untuk menyiapkan adsorben untuk HIC, tetapi yang paling banyak digunakan adalah agarosa. Ketika teknik ini diadaptasikan ke High Performance Liquid Chromatography (HPLC), silika dan resin polimer organik telah digunakan. Hal ini karena elusi dilakukan pada kekuatan ionik rendah, adsorben sebaiknya bebas muatan untuk menghindari interaksi ionik antara protein dan matriks. Ligan yang paling banyak digunakan untuk HIC adalah alkana rantai linier, dengan atau tanpa gugus amino terminal. Secara umum, ligan alkil (butil dan oktil) menunjukkan hidrofobik murni. Kekuatan interaksi antara protein dan ligan hidrofobik meningkat seiring dengan peningkatan panjang rantai karbon. Namun, untuk protein dengan kelarutan yang buruk dalam buffer dengan konsentrasi garam tinggi (protein membran), disarankan untuk menggunakan adsorben HIC dengan ligan yang cukup panjang.

Fase Gerak HIC

HIC memerlukan adanya ion-ion garam tertentu, yang secara preferensi mengikat molekul-molekul air yang teratur dan dengan demikian mendorong terjadinya interaksi hidrofobik. Baik anion maupun kation dapat diurutkan dalam sebuah deret yang disebut deret Hofmeister (lyotropic), mulai dari yang sangat mendukung interaksi tersebut hingga yang akan mengurangi gaya hidrofobik. Ketergantungan HIC terhadap suhu tidak sederhana, meskipun secara umum peningkatan suhu akan meningkatkan retensi protein dan penurunan suhu akan mendorong elusi protein. Namun, protein yang tidak stabil sebaiknya dipisahkan pada suhu rendah.

Pemisahan dengan HIC sering kali dirancang menggunakan kondisi yang hampir berlawanan dengan yang digunakan dalam IEXC. Dalam HIC, protein dipisahkan terutama berdasarkan daerah hidrofobik pada strukturnya, sedangkan perbedaan muatan memiliki dampak yang kecil terhadap selektivitas. Kromatografi interaksi hidrofobik, secara umum, merupakan metode yang sangat lembut. Kerusakan struktural pada biomolekul sangat minimal, tentu saja berkat pengaruh stabilisasi garam dan juga berkat interaksi yang relatif lemah dengan matriks. Meskipun demikian, tingkat pemulihan seringkali tinggi. Dengan demikian, HIC menggabungkan karakteristik non-denaturasi dari presipitasi garam dan presisi kromatografi untuk menghasilkan tingkat pemulihan aktivitas yang sangat baik.

2. Reverse Phase Chromatography (RPC)

RPC dan teknik yang sangat terkait dengannya yaitu HIC, keduanya didasarkan pada interaksi antara ligan hidrofobik yang terikat secara kovalen pada adsorben dan bagian hidrofobik dari molekul yang terdapat dalam fase gerak berair. Adsorben yang digunakan dalam kedua teknik tersebut berbeda dalam hal adsorben, untuk RPC memiliki tingkat substitusi ligan hidrofobik yang sepuluh kali lipat lebih tinggi daripada yang digunakan untuk HIC. Hal ini menyebabkan interaksi hidrofobik dalam RPC cukup kuat untuk mengadsorpsi protein dalam air murni. Namun, interaksi yang sangat kuat yang dihasilkan biasanya memerlukan penggunaan pelarut organik dan aditif lain untuk mendesorpsi protein. Hal ini seringkali akan menimbulkan efek denaturasi pada protein.

Fase Diam RPC

Matriks dasar yang paling umum untuk gel RPC adalah butiran silika berpori dengan gugus Si-OH yang dimodifikasi untuk mengikat ligan. Butiran silika memiliki kekuatan mekanis yang tinggi dan juga stabil secara kimiawi dalam pelarut organik yang biasanya digunakan untuk RPC. Namun, ikatan antara ligan dan gugus Si-OH tidak stabil secara kimiawi pada nilai pH tinggi (>7,5).

Rantai karbon yang lebih pendek (C2-C8) umumnya digunakan untuk pemisahan protein, guna menghindari interaksi yang terlalu kuat yang memerlukan konsentrasi modifikator organik yang lebih tinggi untuk elusi. Namun, rantai alifatik yang lebih panjang (C8-C18) lebih disarankan untuk pemisahan peptida yang lebih kecil.

Polimer organik sintetis, misalnya polistiren berbentuk butiran, juga tersedia sebagai gel fase terbalik. Tidak seperti gel silika, pengisi polimer organik stabil pada nilai pH hingga 12. Namun, pengisi ini biasanya tidak sekuat secara mekanis dan cenderung menyusut atau mengembang saat terpapar pelarut yang berbeda. Butiran ini memiliki permukaan yang sangat hidrofobik sehingga tidak diberi gugus fungsional.

Fase Gerak RPC

Kondisi pengikatan fase gerak awal yang digunakan dalam RPC sebagian besar bersifat akuatik dengan tingkat struktur air terorganisir yang tinggi di sekeliling media kolom yang secara alami bersifat sangat hidrofobik. Hal ini menyebabkan pengikatan protein yang biasanya sangat kuat dan memerlukan penggunaan pelarut organik dalam fase gerak untuk elusi. Pelarut organik akan menurunkan polaritas, dan semakin rendah polaritas fase gerak, semakin besar pula daya elusinya. Retensi relatif suatu polipeptida atau protein tertentu menurun berdasarkan urutan modifikator pelarut berikut pada persentase volume yang sama: metanol < etanol < asetonitril < isopropanol.

Teknik ini umumnya digunakan untuk pemeriksaan kemurnian dan analisis kontrol kualitas, ketika pemulihan aktivitas dan struktur tersier tidak menjadi hal yang esensial. Untuk protein yang lebih kecil (Mw <30.000), efek denaturasi seringkali minimal atau dapat dengan cepat dibalik, sehingga RPC dapat digunakan dengan sukses untuk mengisolasi protein tersebut dalam bentuk yang aktif secara biologis. Polipeptida yang lebih pendek biasanya tidak memiliki struktur sekunder yang nyata untuk dilestarikan, sehingga tidak dapat mengalami denaturasi dalam arti konvensional; itulah sebabnya RPC sering menjadi metode pemurnian pilihan dalam kasus-kasus ini.

D. Affinity Chromatography

Istilah kromatografi afinitas pada awalnya merujuk pada penggunaan ligan alami yang diimobilisasi, yang berinteraksi secara spesifik dengan protein yang diinginkan, namun kemudian diberi makna yang cukup berbeda oleh para penulis yang berbeda. Terkadang istilah ini memiliki cakupan yang sangat luas dan mencakup segala jenis teknik kromatografi adsorpsi yang didasarkan pada ligan non-tradisional, sehingga digunakan dalam arti yang lebih umum mengenai daya tarik. Dalam kasus lain, istilah ini hanya merujuk pada interaksi spesifik antara pasangan fungsional biologis yang berinteraksi di situs pengikatan alami.

Fase Diam AC

Untuk aplikasi kromatografi afinitas, bahan gel yang ideal harus memiliki karakteristik tertentu. Pertama-tama, bahan tersebut harus memiliki gugus kimia yang sesuai agar ligan dapat dikaitkan secara kovalen serta memiliki luas permukaan yang relatif besar untuk proses pengikatan. Kondisi ekstrem yang digunakan selama derivatisasi menuntut agar matriks tersebut stabil baik secara kimia maupun mekanis. Matriks tersebut juga harus inert terhadap pelarut dan buffer yang digunakan dalam proses tersebut, yang bisa cukup keras, terutama selama elusi protein. Matriks hidrofilik dan netral lebih disukai, untuk mencegah protein berinteraksi secara nonspesifik dengan matriks gel itu sendiri. Matriks harus bersifat makro poros agar dapat mengakomodasi interaksi bebas protein berukuran besar dengan ligan, namun juga harus memiliki sifat aliran yang baik. Sejumlah matriks manik-manik berpori sintetis organik dan anorganik juga tersedia, misalnya dekstran yang terikat silang, polistiren, poliakrilamida, selulosa, kaca berpori, dan silika.

Fase Gerak AC

Dalam kromatografi afinitas, diperlukan tingkat kehati-hatian tertentu agar ikatan antara molekul target dan ligan dapat terjadi secara optimal. Kondisi buffer ikatan yang ideal dioptimalkan untuk memastikan bahwa molekul target berinteraksi secara efektif dengan ligan dan tertahan oleh media afinitas, sementara interaksi non spesifik diminimalkan. Pada fase elusi, kondisi buffer diubah untuk memutus interaksi antara molekul target dan ligan, sehingga molekul target dapat dielusi dari kolom. Salah satu sifat yang perlu mendapat perhatian khusus adalah kekuatan asosiasi antara ligan dan kontra-ligan. Jika terlalu lemah, tidak akan terjadi adsorpsi, sedangkan jika terlalu kuat, akan sulit untuk melarutkan protein yang teradsorpsi. Selalu penting untuk menemukan kondisi yang mendukung disosiasi kompleks tanpa pada saat yang sama merusak protein aktif dan mendegradasi matriks. Hal ini sering kali menjadi kesulitan utama dalam kromatografi afinitas.

Affinity Chromatography dapat diaplikasikan pada jenis purifikasi protein berikut:

1. Immunoaffinity
2. Purification of Immunoglobulins
3. Purification of Glycoconjugates
4. Purification of DNA-Binding Proteins
5. Purification of Receptor Proteins
6. Purification of Enzymes
7. Purification by the use of Synthetic Dye Ligands
8. Isolation of Cells
9. Isolation of Nucleotides

INDOGEN dapat membantu menyuplai reagen yang Anda butuhkan untuk riset terkait Affinity Chromatography dari brand Elabscience. Elabscience merupakan manufaktur terpercaya yang menyediakan berbagai macam kebutuhan produk kit purifikasi protein, biochemical reagent, protein, dan berbagai kit riset lainnya. Berikut merupakan daftar produk Elabscience yang berkaitan dengan Affinity Chromatography.

Tabel 1. Daftar Produk Elabscience yang Berkaitan dengan Affinity Chromatography.

E. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)

Kromatografi afinitas logam terimobilisasi (IMAC) bergantung pada pembentukan ikatan koordinasi lemah antara ion logam terimobilisasi dan beberapa asam amino pada protein, terutama residu histidin.

Fase Diam IMAC

Pada dasarnya, persyaratan media penyangga dalam IMAC sama dengan yang berlaku pada kromatografi afinitas; mudah diderivatisasi, tidak menunjukkan adsorpsi nonspesifik, serta memiliki stabilitas fisik, mekanis, dan kimia yang baik. Agarosa berbutir merupakan media penyangga yang paling banyak digunakan.

Fase Gerak IMAC

Kolom chelate logam kemungkinan memiliki muatan keseluruhan karena gugus chelate bermuatan negatif, logam-logamnya bermuatan positif, dan muatan-muatan tersebut tidak selalu saling meniadakan. Oleh karena itu, larutan penyangga dengan kekuatan ionik yang relatif tinggi (mengandung 0,1 hingga 1,0 M NaCl) sebaiknya digunakan untuk mengurangi adsorpsi ionik non-spesifik. Karena adsorpsi protein ke media IMAC hanya mungkin terjadi jika atom nitrogen imidazol pada residu histidil tidak terprotonasi, maka larutan penyangga ikatan harus memiliki pH netral atau sedikit basa.

Keunggulan IMAC seperti stabilitas ligan, muatan protein yang tinggi, elusi ringan, regenerasi sederhana, dan biaya yang rendah. Selain itu, IMAC memiliki interaksi yang tidak bergantung pada struktur, sehingga dapat diterapkan dalam kondisi denaturasi.

F. Size Exclusion Chromatography (SEC)

Pengaturan proses yang sedikit berbeda digunakan dalam Kromatografi Eksklusi Ukuran (SEC). Semua teknik yang telah dibahas sebelumnya memisahkan protein berdasarkan sifat tertentu yang memungkinkan interaksi dengan matriks tertentu, sehingga menyebabkan perlambatan pada protein yang tidak memiliki sifat tersebut. Dalam SEC, matriksnya terdiri dari partikel berpori dan pemisahan justru dilakukan berdasarkan ukuran dan bentuk molekul.Teknik ini juga disebut sebagai filtrasi gel, kromatografi saringan molekuler, atau kromatografi permeasi gel.

Fase Diam SEC

Media SEC komersial pertama, Sephadex, terdiri dari dekstran yang diikat silang dengan epiklorohidrin. Saat ini, banyak gel yang tersedia secara komersial dengan rentang porositas yang luas. Permukaan media ini sebagian besar mengandung gugus hidroksil dan menyediakan lingkungan yang baik bagi protein hidrofilik. Namun, sifat hidrofilik tersebut sedikit berkurang akibat penambahan reagen ikatan silang. Beberapa polimer, seperti agarosa, mampu membentuk gel secara spontan di bawah kondisi yang tepat.

Fase Gerak SEC

Berbeda dengan jenis media lainnya, selektivitas matriks SEC tidak dapat disesuaikan dengan mengubah komposisi fase gerak. Idealnya, tidak terjadi adsorpsi, dan fase gerak sebaiknya dianggap sebagai fase pembawa, bukan fase yang memiliki pengaruh besar terhadap kromatografi. Namun, sampel mungkin memerlukan larutan penyangga dengan nilai pH dan komposisi ionik yang telah ditentukan secara tepat, yang dipilih untuk menjaga struktur dan aktivitas biologis zat-zat yang menjadi objek penelitian.

SEC dapat diaplikasikan pada jenis purifikasi protein berikut:

1. Pertukaran buffer
2. Fraksinasi protein
3. Penentuan ukuran molekul

Referensi:

1. Chromatographic methods for protein purification | ResearchGate
2. Chromatographic fractionation procedures | Springer Nature Link
3. 〈621〉CHROMATOGRAPHY

Artikel Terkait:

1. Isolasi dan Purifikasi Protein dengan Kit Komersial – PT Indogen Intertama