A. Mengapa Isolasi Protein merupakan Tahap yang Penting?

Isolasi dan purifikasi merupakan tahap pemrosesan hilir dalam pembuatan bioproduk dari bahan baku seperti media fermentasi, sel homogenat, atau bahan biologis lain. Sumber utama protein berasal dari hewan dan tanaman. Perbedaan bahan baku ini akan membedakan teknik isolasi dari tiap bahan baku yang digunakan. Penting bagi peneliti atau industri untuk memastikan prosedur isolasi yang dilakukan telah sesuai dengan bahan baku yang digunakan.  Proses isolasi yang ditujukan untuk memperoleh produk dalam bentuk larutan akan mengandung protein target yang bercampur dengan protein lain serta kontaminan lainnya yang memiliki sifat fisikokimia yang berbeda. Maka dari itu, perlu adanya proses purifikasi untuk memperoleh produk dengan tingkat kemurnian yang tinggi.

B. Workflow Isolasi Protein Modern

Langkah pertama yang dilakukan untuk isolasi protein adalah preparasi sampel. Seperti yang telah disampaikan sebelumnya. Preparasi sampel sangat bermacam dan harus menyesuaikan jenis sampel yang digunakan. Berikut merupakan preparasi sampel sel secara umum:

1. Suspension cell:
2. Pindahkan suspensi sel ke tabung EP yang telah didinginkan sebelumnya.
3. Sentrifugasi pada 4°C dengan kecepatan 1000xg selama 10 menit untuk membuang supernatan.
4. Cuci dengan PBS (0,01 M, pH 7,4) pada suhu 2-8°C.
5. Sentrifugasi pada 4°C dengan kecepatan 1000xg selama 10 menit untuk membuang supernatan, lalu sisakan endapan untuk digunakan.
6. Adherent cell:
7. Buang larutan kultur dan cuci sel sebanyak 2 kali dengan PBS (0,01 M, pH 7,4) pada suhu 2-8°C.
8. Kikis sel menggunakan scraper atau menggunakan larutan EDTA, tiup sel hingga lepas menggunakan pipet dan pindahkan suspensi sel ke tabung EP yang telah didinginkan sebelumnya.
9. Sentrifugasi pada 4°C dengan kecepatan 1000xg selama 10 menit untuk membuang supernatan.
10. Cuci dengan PBS (0,01 M, pH 7,4) pada suhu 2-8°C.
11. Sentrifugasi pada 4°C dengan kecepatan 1000xg selama 10 menit untuk membuang supernatan, lalu sisakan endapan untuk digunakan.

Gambar 1. Protein Purification Workflow

Berdasarkan Gambar. 1, secara general langkah isolasi dan purifikasi protein dapat dilakukan dengan tahapan berikut.

1. Persiapan sampel (sel, jaringan, atau mikroorganisme).
2. Lisis sel.
3. Klasifikasi sampel (sentrifugasi/filtrasi).
4. Purifikasi menggunakan kromatografi.
5. Desalting atau buffer exchange.
6. Analisis kualitas protein

Langkah terakhir ini untuk memastikan kemurnian, identitas, dan fungsionalitas protein yang telah dimurnikan. Secara umum, metode yang dapat digunakan yaitu:

1. Elektroforesis
2. Spektroskopi
3. Uji Aktivitas
4. Teknik canggih seperti Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, X-ray crystallography, dan Mass Spectrometry.

C.  Apa yang Dimaksud Kromatografi Protein dan Apa Saja Jenisnya?

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang melibatkan perlambatan molekul dengan pelarut yang bergerak melalui suatu material. Kromatografi kolom, teknik ini umum digunakan untuk pemisahan protein. Fase stasioner dimasukkan dalam kolom yang dilalui fase gerak (eluen) yang dipompa. Interaksi molekul dengan fase stasioner akan menentukan cepat lambatnya molekul tersebut dibawa oleh fase gerak. Kromatografi protein memiliki berbagai jenis, antara lain:

1. Ion Exchange Chromatography (IEXC)

Salah satu teknik pemurnian protein yang paling efektif digunakan untuk pemisahan protein, polipeptida, asam nukleat, polinukleotida, dan biomolekul bermuatan lainnya. Pemisahan ini terjadi akibat persaingan antara protein dengan muatan permukaan yang berbeda untuk kelompok bermuatan berlawanan pada adsorben penukar ion.

Keunggulan:

1. Elusi berlangsung dalam kondisi ringan, sehingga protein dapat mempertahankan konformasi aslinya selama proses kromatografi.
2. Penukar ion memiliki substitusi yang lebih padat dibanding adsorben lain.
3. Spesifitas yang luas memungkinkan proses penghilangan kontaminan dapat signifikan.
4. Resin penukar ion bersifat sangat kuat dan dapat disterilkan di tempat serta dapat digunakan untuk ratusan siklus.

Kelemahan:

1. Keterbatasan selektivitas

2. Chromatographic Methods Based on Hydrophobicity

Protein dapat dipisahkan berdasarkan perbedaan hidrofobisitasnya dengan 2 metode, yaitu:

1. Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
   HIC didasarkan pada interaksi reversibel antara permukaan protein dan sorben kromatografi yang sifatnya hidrofobik. Protein-protein tersebut akan dipisahkan berdasar perbedaan jumlah asam amino hidrofobik yang terdeteksi. Adanya interaksi hidrofobik, campuran protein yang dimuat dalam kolom berisi buffer dengan konsentrasi garam yang tinggi.
2. Reverse Phase Chromatography (RPC)
   RPC merupakan jenis yang paling sering digunakan sebagai teknik  High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Hal ini karena daya pisah yang tinggi dapat diterapkan untuk pemisahan, pemurnian, dan analisis polipeptida kecil serta fragmen proteolitik.

3. Affinity Chromatography

Affinity chromatography adalah teknik pemurnian yang menyederhanakan proses isolasi dengan memanfaatkan hubungan ikatan ligan yang sudah ada dan dirancang agar sangat spesifik. Sehingga, affinity chromatography mampu memberikan daya pemurnian yang sangat tinggi. Selain itu, teknik ini memiliki ciri lain yakni molekul aktif sering kali dapat dipisahkan dalam bentuk terdenaturasi atau berbeda secara fungsional.

4. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)

IMAC bergantung pada pembentukan ikatan koordinasi lemah antara ion logam terimobilisasi dan beberapa asam amino pada protein, terutama residu histidin. Keunggulan IMAC seperti stabilitas ligan, muatan protein yang tinggi, elusi ringan, regenerasi sederhana, dan biaya yang rendah. Selain itu, IMAC memiliki interaksi yang tidak bergantung pada struktur, sehingga dapat diterapkan dalam kondisi denaturasi.

5. Size Exclusion Chromatography (SEC)

Berbeda dengan 4 teknis yang lainnya dimana pemisahan protein berdasar sifat tertentu yang memungkinkan interaksi dengan matriks tertentu, sehingga menyebabkan perlambatan protein yang tidak memiliki sifat tersebut. SEC memiliki matriks yang terdiri dari partikel berpori dan pemisahan berdasarkan ukuran dan bentuk molekul. Keunggulan utama SEC adalah memiliki interaksi yang ringan dan tidak merusak sampel sehingga memungkinkan preservasi aktivitas biologis yang tinggi.

D. Produk Reagen yang Penting dalam Purifikasi Protein

INDOGEN dapat membantu menyuplai reagen yang Anda butuhkan untuk riset terkait isolasi protein dari brand Solarbio. Solarbio merupakan manufaktur terpercaya yang menyediakan berbagai macam kebutuhan produk  chemical reagent, biochemical reagent, dan protein. Berikut merupakan daftar produk Solarbio yang berkaitan dengan isolasi protein.

Tabel 1. Daftar Produk Solarbio yang Berkaitan dengan Isolasi Protein.

Untuk pertanyaan produk dan stock lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kontak yang tertera pada laman website Indogen berikut. Terima kasih.

Referensi:

1. Isolation and Purification of Proteins
2. Critical reflections on synthetic gene design for recombinant protein expression
3. An Introduction to Protein Purification: Methods, Technologies and Applications
4. Chromatographic methods for protein purification | ResearchGate

Artikel Terkait:

Isolasi dan Purifikasi Protein dengan Kit Komersial – PT Indogen Intertama