Analisis sitotoksisitas merupakan pengukuran kemampuan suatu zat atau senyawa untuk menyebabkan kerusakan atau kematian sel. Sel yang terpapar zat sitotoksik dapat mengalami berbagai bentuk kerusakan sel, misalnya gangguan membran sel, pengikatan reseptor yang tidak dapat diubah, penghambatan biosintesis protein, pemanjangan polideoksinukleotida, dan reaksi enzimatik yang mencegah proliferasi. Sel-sel ini juga dapat mengalami berbagai jenis proses kematian seperti apoptosis (kematian sel terprogram), nekrosis (kematian sel tidak terkendali), dan autophagy.

Analisis sitotoksisitas atau viabilitas sel secara in vitro adalah langkah pertama untuk memeriksa apakah suatu zat menyelamatkan atau membunuh sel. Analisis sitotoksisitas dan uji viabilitas sel pada sel yang dikultur banyak digunakan dalam penelitian dasar dan diskoveri obat untuk mengawasi senyawa beracun. Dengan demikian, sitotoksisitas dalam diskoveri obat merupakan titik akhir yang penting untuk mengevaluasi karakteristik dan efek suatu zat pada sel.

Jenis Pengujian Sitotoksisitas dan Viabilitas Sel In Vitro

Analisis sitotoksisitas dan viabilitas sel dapat dikategorikan berdasarkan berbagai parameter, namun disini uji tersebut akan dapat dikategorikan berdasarkan jenis prinsip metode, yaitu eksklusi dye, uji kolorimetri, uji fluorometri. dan uji luminometri.

Gambar 1. Metode in vitro untuk menganalisis tingkatan sel yang rusak, mati atau hidup.

Metode Eksklusi Dye (Pewarna)

Metode eksklusi dye atau pewarna adalah metode paling sederhana dan banyak digunakan untuk memperkirakan jumlah sel hidup dan/atau sel sehat. Dalam teknik ini, pewarna dikeluarkan (dieksklusikan) oleh sel-sel hidup atau sehat, sedangkan sel-sel mati akan menyerap pewarna tersebut. Metode ini juga memungkinkan penentuan integritas membran membran dalam sel. Dye seperti eosin, Congo red, erythrosine B dan trypan blue digunakan untuk metode eksklusi pewarna ini. Trypan blue merupakan dye yang paling banyak digunakan. Namun, metode ini tidak sesuai dalam praktik eksperimental dengan ukuran sampel yang besar dan waktu yang lama.

Beberapa faktor perlu diperhatikan misalnya pada sel-sel yang rusak parah memerlukan waktu beberapa hari untuk kehilangan integritas membran sepenuhnya, sedangkan sel-sel yang hidup tetap berproliferasi. Oleh karena itu, faktor-faktor ini dapat menyebabkan kesalahan estimasi untuk sel-sel mati. Penting diketahui, dye dimaksudkan untuk cell line tersuspensi dan tidak direkomendasikan untuk digunakan langsung pada sel monolayer, melainkan hanya dapat digunakan setelah trypsinisasi sel monolayer.

Eksklusi Trypan Blue (TBE)

Metode TBE digunakan untuk memperkirakan jumlah sel hidup dan sel mati dalam suspensi sel. Trypan blue adalah pewarna diazo yang sering digunakan untuk mewarnai sel-sel mati secara selektif yang berwarna biru. Sifat spesifik dye ini adalah bermuatan negatif, kedap membran dan hanya memasuki sel dengan membran yang rusak. Setelah memasuki sel, trypan blue juga berikatan dengan protein intraseluler sehingga seluruh sel berwarna biru. Dalam metode TBE, suspensi sel dan tripan biru dicampur, kemudian penilaian visual dilakukan untuk mengukur penyerapan atau pengeluaran dye tersebut. Kelebihan: sederhana, mudah dilakukan, murah, waktu lebih relatif singkat, indikator integritas membran yang baik. Kekurangan: ketidakakuratan penghitungan pada haemocytometer, filing yang tidak sempurna, gelembung udara di haemocytometer, tidak sesuai untuk highthrouput sampel, tidak untuk efek sitotoksik progresif, serta sulit membedakan perbedaan antara sel hidup sehat dan sel lemah.

Material yang diperlukan pada metode TBE:

(a) PBS atau media bebas serum.

(b) 0,4% trypan blue disiapkan dalam PBS

(c) Haemocytometer untuk penghitungan sel.

(d) Larutan tripsin EDTA

Protokol umum teknik TBE:

(a) Jumlah sel yang memadai (adheren atau non-adheren) dikultur dalam 24-well plate dan diinkubasi pada suhu 37 °C dan 5% CO2 selama beberapa waktu (18-24 jam). Waktu inkubasi ini memungkinkan sel untuk menempel pada bagian bawah pelat (untuk cell line yang melekat).

(b) Setelah sel melekat, campur sel tersebut dengan konsentrasi atau dosis berbeda dari senyawa tertentu, diikuti dengan inkubasi selama beberapa periode perlakuan (misalnya 24, 48, dan 72 jam).

(c) Setelah inkubasi selesai, cuci sel yang diberi perlakuan dan yang tidak diberi dengan PBS dan siapkan suspensi sel dari masing-masing pelat secara terpisah.

(d) Sentrifugasi suspensi sel yang telah diberi perlakuan selama 5 menit pada 100 Å ~ g.

(e) Buang supernatan lalu suspensikan kembali pelet sel dalam 1 ml PBS atau media tidak lengkap (media tanpa serum). Karena protein serum dapat terwarnai dengan tripan biru, hasilnya kan menjadi ambigu sehingga direkomendasikan untuk melakukan penentuan dengan larutan bebas serum.

(f) Campurkan suspensi sel dengan perbandingan 1:1 dan trypan blue (4% b/v dalam PBS) dan inkubasi campuran tersebut selama 3 menit pada suhu kamar (RT). Pastikan sel dihitung dalam waktu 3–5 menit setelah pencampuran dilakukan. Masa inkubasi yang lebih lama dapat menyebabkan kematian sel dan mengurangi jumlah sel yang hidup serta menghasilkan hasil positif palsu.

(g) Untuk menentukan apakah sel menyerap atau mengeluarkan pewarna, observasi setetes campuran sel / trypan blue pada haemocytometer dan hitung sel hidup (viable) dan sel mati (non-viable) secara terpisah. Sel-sel hidup akan tampak transparan dan sel-sel mati berwarna biru tua.

(h) Jumlah sel hidup per ml aliquot diperoleh dengan mengalikan jumlah sel hidup dengan 2 (faktor pengenceran trypan biru).

(i) Hitunglah persentase (%) sel yang hidup dengan menggunakan persamaan berikut:

Pada prosedur ini, 1 aliquot mewakili jumlah suspensi sel yang ditambahkan di setiap sumuran well-plate. Jumlah total sel per ml aliquot adalah jumlah total sel yang dikultur pada setiap sumuran dan jumlah total sel viabel per ml aliquot diperoleh (h). Hasilnya disajikan dalam bentuk grafik yang menunjukkan konsentrasi senyawa (misalnya obat) yang diberikan pada sumbu x dan persentase sel yang hidup pada sumbu y.

Metode Kolorimetri

Metode kolorimetri adalah metode yang paling banyak digunakan dalam estimasi viabilitas sel dan sitotoksisitas. Metode kolorimetri dirancang berdasarkan kuantifikasi indikator biokimia untuk memperkirakan aktivitas metabolisme sel. Reagen akan berubah warna sebagai reaksi terhadap sel yang hidup, sehingga memungkinkan kuantifikasi kolorimetri viabilitas sel dengan spektrofotometer. Berbeda dengan metode eksklusi dye, metode sesuai  untuk cell line yang melekat dan tersuspensi. Uji kolorimetri sederhana dan mudah dilakukan, serta cukup murah.

Pengujian MTT

MTT [kepanjangan: 2-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-3, 5-difenil2H tetrazolium bromida] adalah garam tetrazolium berwarna kuning. Pengujian MTT merupakan pendekatan kolorimetri sederhana untuk memperkirakan sitotoksisitas atau viabilitas sel. Teori dasar metode ini yaitu viabilitas sel diperkirakan dengan menentukan fungsi mitokondria sel, dimana dilakukan dengan menilai aktivitas reduktase mitokondria seperti suksinat dehidrogenase. Pada uji MTT, NADH sel viabel akan mereduksi MTT menjadi kristal formazan tidak larut (berwarna ungu). Keberadaan sel viabel akan menghasilkan lebih banyak kristal formazan yang harus disuspensikan dengan menggunakan deterjen seperti DMSO atau isopropanol. Hanya bentuk formazan tersuspensi yang dapat diukur pada well-plate 96 dengan menggunakan spektrofotometer atau plate reader.

Warna ungu lebih gelap dan absorbansi tinggi menunjukkan peningkatan jumlah sel hidup, sedangkan warna ungu pudar dan penurunan absorbansi menunjukkan penurunan jumlah sel hidup, selain juga menunjukkan efek sitotoksik dari senyawa yang digunakan. Penggunaan multi well-plate memfasilitasi kemudahan persiapan eksperimen untuk sampel dalam jumlah besar dalam waktu yang sangat singkat. Keunggulan: sederhana, aman, reproduktifitas tinggi dan mudah digunakan. Kelemahan: membutuhkan pelarut organik (seperti DMSO atau isopropanol) untuk Formazan MTT karena tidak larut dalam air, serta rangkaian percobaan kontrol tambahan meminimalkan risiko hasil positif/negatif palsu oleh background jika menggunakan serum dan/atau fenol merah dalam media.

Material yang diperlukan pada metode MTT:

(a) MTT

(b) PBS

(c) Isopropanol atau DMSO

Prosedur metode MTT:

(a) Siapkan larutan MTT dengan melarutkan 5 mg bubuk MTT dalam 1 ml larutan PBS.

(b) Tambahkan 10⁴ sel dan 100 μl media kultur ke setiap sumuran well-plate 96. Perlu diingat untuk mempertimbangkan tiga replikasi untuk setiap konsentrasi. Kemudian inkubasi sel dalam 5% CO2 dan 37 °C selama ~12 jam agar sel dapat melekat pada dasar pelat.

(c) Setelah sel menempel, perlakukan sel dengan berbagai konsentrasi senyawa yang diinginkan, diikuti dengan inkubasi. Masa inkubasi adalah waktu perlakuan yang dibutuhkan(misalnya 24, 48, dan 72 jam).

(d) Setelah masa perlakuan selesai, buang media lalu tuangkan 100 μl media kultur ke dalam masing-masing sumuran diikuti dengan penambahan 10 μl larutan MTT per sumuran. Kemudian simpan well-plate untuk inkubasi dalam 5% CO2 dan 37 °C selama 3–4 jam.

(e) Buang supernatan, diikuti dengan penambahan 100 μl deterjen isopropanol atau DMSO yang sesuai untuk melarutkan kristal formazan yang dibentuk oleh MTT. Homogenisasi mengguncang well-plate secara perlahan selama 10–15 menit untuk mendapatkan larutan terlarut secara merata.

(f) Bacalah well-plate pada panjang gelombang 570 nm.

(g) Hitunglah persentase sel yang hidup sebagai berikut:

(h) Data dilaporkan dalam bentuk diagram kelangsungan hidup sel.

Gambar 2. MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) CAS: 298-93-1 merk Indochemical

Pengujian XTT

XTT atau natrium 3′-[1-(fenilaminokarbonil)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksi6-nitro) benzena asam sulfonat hidrat, mirip dengan MTT, reagen ini juga merupakan garam tetrazolium sebagai alternatif MTT untuk mengeliminasi langkah tambahan pada MTT dalam pelarutan Formazan. Pada teknik ini, XTT direduksi menjadi formazan berwarna oranye di dalam sel aktif secara metabolik. Mekanisme yang mendasari reduksi XTT adalah sistem succinoxidase mitokondria dan sitokrom P450 serta flavoprotein oxidase. XTT larut dalam air sehingga menyederhanakan pengukuran intensitasnya dengan spektrofotometer. Selain itu, teknik XTT sederhana untuk mengukur proliferasi sel. Dengan demikian, teknik ini merupakan solusi terbaik untuk mengukur sel, menentukan viabilitas dan juga sitotoksisitas. Keunggulan: relatif cepat, sensitif, nyaman, aman, akurasi dan sensitivitas lebih tinggi. Kelemahan: perubahan dalam kecenderungan reduksi sel-sel yang hidup akibat tindakan regulasi enzimatik, pH, konsentrasi ion dalam sel, variasi siklus sel atau pengaruh lingkungan tambahan mungkin mengganggu pembacaan absorbansi.

Material dalam teknik XTT:

(a) XTT

(b) PBS

(c) PMS (Phenazine methosulfate)

Prosedur metode XTT:

(a) 10⁴ sel dengan media kultur 150 μl ditambahkan ke setiap sumuran well-plate 96 dan diinkubasi dalam 5% CO2 dan 37 °C selama 12-24 jam. Untuk setiap konsentrasi, tiga ulangan direkomendasikan.

(b) Setelah inkubasi selesai, buang media, cuci dengan PBS dan tambahkan 150 μl media kultur segar ke setiap sumuran.

(c) Tambahkan berbagai konsentrasi senyawa yang diinginkan ke setiap sumuran dan inkubasi selama waktu perlakuan (misalnya 24, 48 dan 72 jam).

(d) Setelah masa perlakuan selesai, buang media dari masing-masing sumuran dan kemudian tuangkan 100 μl media kultur ke dalam setiap sumur.

(e) Siapkan larutan PMS dengan melarutkan PMS (3 mg) dalam 1x PBS (1 ml).

(f) Siapkan larutan XTT dengan melarutkan XTT (4 mg) dalam media kultur sel (4 ml).

(g) Tambahkan 10 μl larutan PMS ke 4 ml larutan XTT untuk membuat larutan deteksi.

(h) Segera tambahkan 50 μl larutan deteksi ke setiap sumuran.

(i) Inkubasi selama 2–5 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO2.

(j) Tempatkan reaksi di shaker untuk mencampurkan pewarna ke dalam larutan.

(k) Segera ukur absorbansi pada panjang gelombang 450 nm.

(l) Persentase kelangsungan hidup sel dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

(m) Hasil uji XTT disajikan dalam bentuk grafik inhibisi sel.

Tip: Larutan XTT dan larutan PMS masing-masing dapat disimpan pada suhu −20 °C di tempat gelap dan harus stabil selama 9 bulan. Jika larutan XTT berubah warna atau membentuk kristal, tidak direkomendasikan untuk digunakan dan buanglah dengan benar.

Sulforhodamine B (SRB) Assay

Pengujian SRB adalah teknik kolorimetri yang cepat dan sensitif yang digunakan untuk menentukan sitotoksisitas pada kultur sel yang melekat dan tersuspensi. SRB adalah dye aminoxanthene merah muda yang terdiri dari dua gugus sulfonat. Dalam kondisi sedikit asam, SRB akan berinteraksi dengan residu asam amino basa dari protein dalam sel terfiksasi asam trikloroasetat (TCA) untuk menghasilkan indeks sensitif protein. Metode SRB digunakan untuk mengukur pembentukan dan penghilangan (extinction) koloni sel. Kelebihan: cepat, mudah dan sensitif, linearitas sangat baik dengan jumlah sel, memungkinkan saturasi konsentrasi dye, tidak bergantung pada metabolisme perantara, menghasilkan titik akhir determinan, tidak terlalu sensitif terhadap variasi lingkungan dan reproduktifitas tinggi. Kekurangan: membutuhkan suspensi sel homogen, serta gumpalan atau agregat seluler harus dihindari untuk kinerja efisien.

LDH Assay

Teknik LDH (lactate dehydrogenase) adalah metode kolorimetri untuk menilai sitotoksisitas seluler dengan menentukan jumlah enzim LDH stabil di sitosol yang dikeluarkan oleh sel-sel yang rusak. Enzim LDH biasanya ditemukan di dalam sitoplasma sel. Ketika viabilitas sel berkurang, membran plasma menjadi lebih berpori sehingga enzim LDH dilepaskan ke dalam media kultur sel. LDH yang dilepaskan ditentukan secara kuantitatif dengan reaksi enzimatik berpasangan, di mana diaphorase (katalis) mengubah garam tetrazolium [iodonitrotetrazolium (INT)] menjadi formazan berwarna merah.

Proses diawali dengan LDH mengkatalisis transformasi laktat menjadi piruvat dan NAD direduksi menjadi NADH/H+. Berikutnya, diaphorase mentransfer H/H+ dari NADH/H+ ke INT, yang mana direduksi menjadi formazan berwarna merah. Aktivitas LDH selanjutnya ditentukan sebagai aktivitas oksidasi NADH atau reduksi INT selama waktu tertentu. Absorbansi maksimal formazan merah pada panjang gelombang 492 nm sehingga densitas (OD) diukur pada 490 nm. Triton X-100 adalah deterjen yang sering digunakan sebagai kontrol positif. Kelebihan: menunjukkan kerusakan membran sel (kematian sel tidak reversibel), sangat akurat, cepat dan sederhana. Kelemahan: tidak dapat menentukan kematian sel yang disebabkan oleh kondisi pertumbuhan normal karena hanya dapat dilakukan dan terbatas pada kondisi serum rendah atau tanpa serum (dimana pertumbuhan sel seringkali membutuhkan serum).

Metode Fluorometri dan Luminometri

Seperti dengan kolorimetri, metode fluorometri dan luminometri juga merupakan metode sederhana dalam perkiraan persentase viabilitas sel dan sitotoksisitas. Teknik fluorometri memerlukan platform mikroskop fluoresensi, fluorometer, plate reader fluoresensi atau flowcyometer. Dibandingkan kolorimetri, teknik fluorometri memberikan beberapa keunggulan, mislanya hasil lebih halus (refined and subtle) dibandingkan dengan pengujian kolorimetri. Pengujian luminometri dapat dengan mudah dilakukan pada well-plate microtiter 96 dan 384 sumur  untuk dideteksi dengan plate reader luminometri. Dalam luminometri, penambahan reagen menghasilkan sinyal pendaran cahaya stabil (sinyal cahaya) yang dideteksi oleh luminometer.

Kit komersial untuk pengujian fluorometri dan pengujian luminometri juga tersedia. Namun, kelemahan mendasarnya adalah pengujian fluorometri (berbasis fluoresensi) dan pengujian luminometri, seringkali memerlukan instrumentasi yang mahal dan rumit. Pada akhirnya,  jenis pengujian semua kategori relatif sangat luas dan pilihan assay bergantung pada jenis dan tujuan kegiatan yang dilakukan.

Referensi:

1. Präbst K, Engelhardt H, Ringgeler S, Hübner H. 2017. Basic colourimetric proliferation assays: MTT, WST, and resazurin. In Cell viability assays (pp. 1–17). Humana Press.
2. Śliwka L, Wiktorska K, Suchocki P, Milczarek M, et al. 2016. The comparison of MTT and CVS assays for the assessment of anticancer agent interactions. PLoS One, 11(5), e0155722.
3. Kim SI, Kim HJ, Lee HJ, Lee K, Hong D, Lim H, Cho K, Jung N & Yi YW. 2016. Application of a non-hazardous vital dye for cell counting with automated cell counters. Analytical Biochemistry, 492, 8–12.
4. Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. 2018. Analysis of cell viability by the lactate dehydrogenase assay. Cold Spring Harbor Protocols, 2018(6), pdb-prot095497.
5. Mani S, Swargiary G. 2023. In Vitro Cytotoxicity Analysis: MTT/XTT, Trypan Blue Exclusion. In Shalini Mani et al.: Animal Cell Culture: Principles and Practice. Springer Nature Switzerland AG.

Artikel Terkait:

1. 4 Alasan Memilih Kit Caspase Assay Merk Elabscience®
2. 4 Alasan Memilih Kit Cell Proliferation and Toxicity Merk Elabscience®
3. 6 Alasan Memilih Kit Deteksi Apoptosis Annexin V Merk Elabscience®
4. 5 Alasan Memilih Kit Deteksi Apoptosis Merk Elabscience®