Berikut merupakan beberapa tahapan untuk mengukur tingkat ekspresi protein permukaan dengan antibodi terkonjugasi fluorokrom (pewarna fluoresen) menggunakan analisis flow cytometry. Pada flow cytometry, jumlah sel >10.000 merupakan jumlah ideal untuk analisis metode ini. Karena adanya kehilangan sel selama prosedur pewarnaan, direkomendasikan untuk menggunakan >100.000 sel per sampel untuk permulaan jika memadai.

A. Harvesting Sel

1) Mencuci sel dengan PBS. Kontrol diperlukan:

(a) sel yang tidak diwarnai,
(b) sampel single-fluorochrome untuk setiap warna,
(c) FMO (Fluorescence Minus One) untuk masing-masing fluorokrom, dimana FMO mengandung semua furokrom kecuali satu fluorokrom yang tidak ada. Pewarnaan populasi sel positif atau negatif terhadap antigen target harus dilakukan dengan menggunakan pengenceran berbeda dari masing-masing antibodi untuk mendapatkan konsentrasi optimal.

2) Menambahkan 0,25% (v/v) tripsin 0,53mM EDTA pada PBS ke dalam flask dan menginkubasikannya pada suhu 37°C hingga sel terlepas. Perhatikan bahwa beberapa protein permukaan dapat didegradasi oleh tripsin sehingga tidak terdeteksi oleh antibodi. Alternatif pelepasan dapat dilakukan secara non-enzimatik atau menggunakan larutan pelepasan lebih lembut (contohnya, Accutase) mungkin lebih sesuai untuk beberapa jenis protein.

3) Menonaktifkan aktivitas trypsin menggunakan medium mengandung serum sekurangnya lima kali dan memindahkan sel ke tabung universal.

4) Sentrifugasi sel pada 300×g selama 3 menit. Perhatikan bahwa beberapa protein permukaan sel (misalnya, reseptor) dapat terinternalisasi pada pengikatan antibodi sehingga untuk pencegahan menggunakan buffer sangat dingin dan sentrifugasi berpendingin.

5) Mengaspirasi media dan mensuspensikan kembali sel di dalam 5 mL PBS. Perhitungan jumlah sel dapat dilakukan menggunakan hemositometer.

6) Sentrifugasi kembali sel pada 300×g selama 3 menit.

7) Mengaspirasi PBS dan mensuspensikan kembali sel hingga 1–5 × 106 sel/mL pada buffer FACS sangat dingin (2% serum di PBS). Perhatikan bahwa natrium azida pada konsentrasi akhir 0,05% dapat ditambahkan ke buffer FACS untuk mencegah pelepasan atau internalisasi antigen. Namun, tidak diperbolehkan untuk menambahkan natrium azida saat melakukan analisis fungsi seluler setelah penyortiran sel selesai.

8) Memindahkan 100μL/pewarnaan ke 96-well plate V-bottom atau tabung universal. Penggunaan 96-well plate V-bottom lebih nyaman untuk menangani banyak sampel dibandingkan tabung universal.

B. Pewarnaan

1) Antibodi primer biasanya diencerkan dalam 0,1–10μg/mL pada buffer FACS. Direkomendasikan untuk menggunakan 100μL antibodi yang diencerkan untuk setiap pewarnaan sampel. Perhatikan bahwa karena konsentrasi antibodi optimal bervariasi, pengenceran serial setiap antibodi untuk optimasi harus diuji.

2) Sentrifugasi plate (atau tabung) pada 300×g selama 3 menit.

3) Supernatan diaspirasi dengan menempatkan ujung aspirator/pipet pada tepi di mana bentuk V dimulai. Perhatikan bahwa tidak perlu membuang seluruh supernatan, cukup hingga tepinya cukup.

4) Menambahkan 100μL antibodi primer yang telah diencerkan sebelumnya pada setiap sampel.

5) Menginkubasi plate (atau tabung) selama 15–30 menit pada suhu 4°C.

6) Selama waktu inkubasi, antibodi sekunder terkonjugasi fluorokrom disiapkan pada buffer FACS berdasarkan pengenceran yang disarankan oleh manual produsen (100μL/sampel). Perhatikan bahwa penyimpanan antibodi terkonjugasi fluorokrom harus pada keadaan gelap. Meskipun banyak fluorokrom terbaru yang cukup stabil terhadap paparan cahaya, namun masih terdapat beberapa yang memiliki stabilitas rendah.

7) Sentrifugasi plate (atau tabung) pada 300×g selama 3 menit. Supernatan diaspirasi dan sel disuspensikan kembali ke dalam 150μL buffer FACS sangat dingin. Pencucian menggunakan buffer FACS sangat disarankan dibandingkan PBS, karena FACS lebih lembut dan juga dapat meminimalkan hilangnya sel dengan mencegah penempelan sel pada plastik. Proses pencucian ini diulangi sekali lagi. Jika antibodi primer langsung terkonjugasi fluorofor, maka dapat dilanjutkan ke langkah 13 (Pewarnaan).

8) Setelah pencucian kedua, sentrifugasi plate (atau tabung) pada 300×g selama 3 menit, supernatan diaspirasi dan sel disuspensikan kembali ke dalam larutan antibodi sekunder.

9) Menginkubasi plate (atau tabung) selama 5–15 menit pada suhu 4°C dalam kondisi gelap.

10) Menyiapkan tabung FACS dengan menambahkan 100–300μL buffer FACS sangat dingin dan biasanya ditambahkan 0,1–1μg/mL DAP (atau fluorokrom pengikat DNA impermeabel membran sel lainya) untuk pewarnaan sel mati. Jika volume awal sel lebih kecil, maka volume pewarna juga lebih kecil. Tabung FACS dengan cell strainer direkomendasikan untuk memisahkan kluster-kluster saat penambahan sel. Langkah harus dilakukan di atas es atau permukaan dingin dan kondisi gelap.

11) Mencuci sel dengan buffer FACS sangat dingin sebanyak dua kali seperti sebelumnya.

12) Mensuspensikan kembali sel ke dalam buffer FACS 100μL dan mentransferkan sel ke tabung FACS yang disiapkan pada langkah 11 (Pewarnaan).

13) Penyimpanan sel dapat dilakukan pada suhu 4°C dalam lingkungan gelap hingga analisis. Untuk hasil yang lebih baik, analisis diharapkan untuk dilakukan sesegera mungkin atau hari yang sama.

14) Analisis: Penyimpanan yang lebih lama (>12–16 jam), sel dapat difiksasi sebelum pewarnaan [setelah langkah 1 (Pewarnaan)]. Metode fiksasi yang optimal bergantung pada jenis antibodi, epitop yang diinginkan dan jenis fluorokrom. Sebanyak 0,01%–1% paraformaldehyde (PFA) selama 10–15 menit atau aseton/metanol sedingin es selama 5–10 menit pada suhu −20°C dapat digunakan untuk fiksasi sel.

C. Akuisisi Data dan Analisis

1) Sumbu FSC (Forward SCatter) mewakilkan ukuran sel, sedangkan sumbu SSC (Side SCatter) mewakilkan granularitas dan kompleksitas sel. Menggunakan parameter FSC dan SSC, populasi sel yang berbeda dan debris dapat dibedakan. Fiksasi sel umumnya dapat mempengaruhi pola sumbu di atas.

Gambar 1. Pembatasan (gating) sel hidup. Menggunakan parameter SSC-A/FSC-A, sel dapat diseleksi dari debris (plot kiri). Dengan mengeluarkan sel positif DAPI, sel hidup dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (plot kanan).

Dalam flow cytometry, pengelompokan sel dengan karakteristik yang sama disebut gating (pembatasan). Pertama, pembuatan gate (pembatas) pada scatter plot dengan parameter FSC dan SSC untuk memisahkan debris dan sel mati untuk analisis lebih lanjut dari populasi sel hidup (Gambar 1).

2) Pembuatan jendela scatter plot untuk semua kombinasi fluorokrom yang digunakan dan menguji sampel kontrol dengan masing-masing pewarnaan warna tunggal.

3) Mengatur voltase laser eksitasi karena sinyal sampel kontrol positif berbeda dari kontrol negatif.

Gambar 2. Spektra dari fluorescein (FITC) dan phycoerythrin (PE). Beberapa emisi fluoresensi dari FITC akan dideteksi oleh detektor yang ditunjuk PE. Keadaan ini disebut overlapping spektral atau spillover dan dapat dikoreksi dengan proses kompensasi. Dengan menggunakan kontrol positif satu warna untuk setiap fluorokrom dan melalui algoritma matematis, spillover dapat dihilangkan dari satu fluorokrom terhadap channel lainnya. Beberapa software dapat mengkompensasi secara otomatis semua kombinasi fluorokrom yang digunakan, asalkan terdapat kontrol positif tunggal yang tepat.

Bergantung pada kombinasi fluorokrom yang digunakan, sinyal yang seharusnya negatif dapat terlihat sebagai sinyal positif. Hal ini dapat terjadi karena spektrum emisi beberapa fluorokrom dapat ditangkap oleh filter yang digunakan untuk fluorokrom lain (Gambar 2). Untuk mengoreksi overlapping spektrum emisi ini, kompensasi fluoresensi dapat digunakan. Kompensasi fluoresensi adalah proses mengoreksi limpahan fluoresensi dengan cara menghilangkan sinyal dari setiap fluorokrom dari semua detektor kecuali yang dikhususkan untuk mengukur pewarna tertentu. Setting kompensasi fluoresensi bervariasi tergantung pada alat dan software, tetapi kebanyakan cytometer modern memungkinkan untuk mengubah pengaturan kompensasi setelah data diakuisisi. Pada prinsipnya setelah kompensasi sesuai, sampel kontrol yang diwarnai dengan fluorokrom tunggal harus memberikan sinyal positif hanya pada saluran deteksi yang ditentukan. Banyak software flow cytometry dapat menghitung kompensasi selama mereka dilengkapi dengan kontrol pewarnaan tunggal untuk semua fluorofor.

4) Setelah parameter akuisisi optimal ditetapkan, uji semua sampel dengan setting yang sama. Jumlah event (jumlah sel) yang akan dicatat bergantung pada proporsi sel dengan sinyal positif yang diinginkan. Pastikan, jumlah event dicatat sesuai kebutuhan untuk analisis data selanjutnya.

Gambar 3. Plot flow cytometry. (A) Histogram sampel menunjukkan distribusi sel mengekspresikan mOrange (kiri) dan Nanog-GFP (kanan) pada sampel yang sama. Sumbu x mewakili intensitas sinyal dari protein fluoresen dan sumbu y mewakili jumlah sel. Data yang sama disajikan dengan empat jenis plot dua dimensi yang berbeda, antara lain (B) plot densitas pseudo-color, (C) plot contour, (D) densitas skala abu-abu, dan (E) plot titik, dimana plot-plot tersebut menunjukkan perbedaan populasi yang tidak dapat diidentifikasi dengan histogram.

Berbagai software sudah banyak tersedia saat ini untuk analisis data (misalnya, FlowJo atau WEASEL). Distribusi nilai masing-masing parameter dapat disajikan dalam histogram dimana sumbu x menampilkan intensitas parameter dan sumbu y menampilkan jumlah sel. Sementara histogram bermanfaat untuk memberikan jumlah sel yang akurat yang menampilkan intensitas sinyal tertentu, plot dua dimensi (plot densitas, plot contour, plot titik) memiliki keunggulan untuk memvisualisasikan korelasi dua parameter untuk setiap sel. Pembatas (gate) baru di dalam plot dapat diatur dan proporsi sel yang akurat di dalam pembatas dapat ditampilkan (Gambar 3).

Tabel 1. Seleksi subpopulasi sel target dengan antibodi flow cytometry dari Elabscience

D. Jenis antibodi primer terkonjugasi fluorokrom

1. Pengujian flow cytometry dari sampel manusia

2. Pengujian flow cytometry dari sampel manusia

E. Referensi
1. Hawley TS, Hawley RG. 2018. Flow Cytometry Protocols. Humana Press.
2. Ortolani C. 2022. Flow Cytometry Today: Everything You Need to Know about Flow Cytometry. Springer.
3. Jalali M, Saldanha FYL, Jalali M. 2017. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Academic Press.

F. Artikel Terkait
1. Introduksi Flow Cytometer dan Prinsip Kerjanya [Link]
2. Bagaimana Memilih Antibodi untuk Flow Cytometry [Link]
3. Cell Line Merk Elabscience [Link]
4. Prosedur Dasar Laboratorium untuk Pemeliharaan Kultur Sel [Link]
5. 4 Metode Mengukur Proliferasi Sel [Link]
6. 6 Alasan Memilih Kit Deteksi Apoptosis Annexin V Merk Elabscience® [Link]
7. 4 Alasan Memilih Kit Cell Proliferation and Toxicity Merk Elabscience® [Link]
8. 5 Alasan Memilih Kit TUNEL Assay Merk Elabscience® [Link]