HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah teknik utama dalam analisis farmasi di Industri Farmasi dan Laboratorium Quality Control Obat untuk berbagai jenis sampel. Metode ini memeriksa kemurnian kandidat obat baru, memonitor perubahan atau peningkatan prosedur sintetik, mengevaluasi formulasi baru, serta meneliti quality control (pengendalian mutu) dan jaminan produk obat akhir. Puluhan ribu tes HPLC dilakukan oleh scientists yang berdedikasi untuk memastikan potensi dan kualitas produk obat baru untuk mendukung setiap aplikasi obat baru atau produk komersial.

Prinsip High Performance Liquid Chromatography

Dalam analisis HPLC, campuran senyawa kimia yang akan diuji terlebih dahulu dilarutkan dalam pelarut cair dan kemudian dipaksa mengalir dengan fase gerak melalui fase diam dalam bentuk kolom (contohnya kolom stainless steel) pada tekanan tinggi. Pada fase diam (kolom), campuran senyawa kimia diuraikan menjadi komponen-komponennya. Besarnya resolusi bersifat esensial dan bergantung pada cakupan interaksi antara komponen zat terlarut dan fase diam.

Fase diam didefinisikan sebagai packing material kolom yang bersifat immobil (tidak bergerak). Fase gerak adalah bagian yang bergerak dari sistem yakninya cairan. Interaksi zat terlarut dengan fase gerak dan fase diam dapat dimanipulasi melalui seleksi jenis pelarut dan kolom. Dengan demikian, HPLC memiliki berbagai macam keunggulan untuk dengan memisahkan berbagai macam campuran kimia, terutama yang mengandung senyawa yang labil secara termal atau mudah teroksidasi dibandingkan jenis kromatografi lainnya.

Komponen sistem HPLC

1. Reservoir pelarut (fase gerak)
2. Pompa (Solvent Manager, Solvent Delivery System)
3. Injektor (Autosampler, Sample Manager)
4. Kolom HPLC (Packing Material)
5. Detektor
6. Kromatogram (Peaks = Kuning, Mearh, Biru)
7. Penampung limbah

Fase Gerak

Fase gerak adalah pelarut murni bebas gas dan partikel, bebas campuran pelarut, atau bebas campuran buffer yang inert terhadap komponen sampel. Fase ini bergerak dengan laju konstan dengan tekanan tinggi yang dihasilkan oleh pompa HPLC dan membawa komponen sampel yang diinjeksikan melalui kolom fase diam.

Pompa (Solvent Delivery System)

Sistem pemompaan fase gerak (unit suplai fase gerak) terdiri dari pompa bertekanan tinggi untuk memaksa fase gerak mengalir melalui sistem HPLC dan memberikan laju aliran mulai 100 µL/menit untuk kolom lubang kecil dan 1–3 mL/menit untuk kolom lainnya. Manometer dan flowmeter pada pompa berfungsi untuk mengukur tekanan sistem dan laju aliran fase gerak. Reservoir fasa gerak berguna untuk menampung fasa gerak yang akan dipompa melalui tabung Teflon (inlet fasa gerak) yang didukung oleh frit logam (filter inlet fasa gerak) untuk filtrasi fasa gerak. Dua mode elusi untuk produk farmasi di laboratorium quality control obat:

• elusi isokratik: fase gerak, baik pelarut murni atau campuran, tetap sama (tidak berubah) selama pemisahan dan running sampel.
• elusi gradien: komposisi fase gerak berubah selama pemisahan dan running sampel.

 Injector (Autosampler)

Sistem injeksi (injektor) terdiri dari katup pengambilan sampel dan loop injektor untuk menginjeksikan sampel ke dalam fase gerak tepat di kepala kolom.

Sistem Pemisahan (Kolom HPLC)

Kolom HPLC terdiri dari dua komponen: packing material kolom (fase diam) dan hardware (wadah) dimana fase diam ditemukan. Pada kolom, komponen sampel dapat dipisahkan menjadi individu-individunya. Dikarenakan fase diam dalam kolom terdiri dari partikel berukuran mikro berbentuk irregular atau bulat, sehingga diperlukan pompa bertekanan tinggi untuk memindahkan fase gerak melalui kolom ini. Oleh karena ini, kolom merupakan komponen pivotal dan inti dari teknik HPLC.

Detektor

Detektor HPLC adalah instrumentasi yang mendeteksi keberadaan komponen kimia dari kolom dan mengkonversi informasi tersebut menjadi sinyal listrik. Detektor tidak hanya memonitor elusi (ekstrak) komponen kimia, tetapi sinyal listrik juga menyediakan hasil kuantitatif. Deteksi dilakukan dengan metode pendeteksian keberadaan zat terlarut yang dipisahkan oleh kolom dan dielusi (diekstrak) dalam fase gerak.

Setelah keluar dari kolom, komponen sampel yang dielusi masuk ke detektor. Detektor mendeteksi waktu kemunculan dan jumlah setiap komponen berdasarkan perubahan komposisi eluen, serta mengonversi informasi yang dikumpulkan menjadi sinyal listrik. Sinyal tersebut kemudian ditransmisikan ke processor dan perekam data.

Jenis detektor HPLC:

• UV absorbance detector (UV detector)
• UV-visible (VIS) absorbance detector (UV/UV–VIS detector)
• Diode array detector (DAD) and photodiode array (PDA) detector
• Conductivity detector
• Electrochemical (EC) detector
• Fluorescence (FL) detector
• RI detector
• Mass spectrometry (MS) detector

 Processor dan Perekam Data

Sinyal listrik yang dikumpulkan oleh detektor diproses oleh software komputer, mengubah data menjadi kromatogram sebagai output dan mencatat informasi. Software akan menghitung sinyal respons dan mengontrol parameter seperti urutan dan volume injeksi, siklus pencucian, panjang gelombang deteksi, dll. Kromatogram adalah jumlah total dan kuantitas semua peak yang diperoleh dari sampel. HPLC membagikan informasi kualitatif seperti bentuk peak, intensitas sinyal untuk membentuk peak, waktu kemunculan peak, serta informasi kuantitatif peak dengan memperkirakan luas setiap puncak yang sebanding dengan konsentrasinya dalam sampel. Software berbasis komputer mengatur penghitungan, kuantifikasi, dan pencatatan informasi tersebut.

Pipa Koneksi

Keberadaan pipa koneksi berfungsi untuk menyatukan bagian-bagian instrumen. Pipa atau tubing menghubungkan bagian-bagian sistem HPLC dan menyediakan jalur fase gerak dari reservoir melalui HPLC dan akhirnya ke limbah. Sambungan antar komponen untuk aliran fluida bertekanan tinggi biasanya memerlukan penggunaan pipa stainless steel dengan lubang kecil.

Tailing Factor

Peak simetris senyawa dalam kromatogram memastikan validasi data yang diperoleh. Namun pada kenyataan, peak asimetris sering terlihat dan sulit dihindari. Peak harus berbentuk simetris seperti kurva Gaussian. Jika lebar peak setengah depan dan setengah belakang berturut-turut adalah m dan n, rasio keduanya disebut tailing factor T = m/n harus sama dengan 1 untuk peak simetris. Namun peak dengan T >1 disebut tailing sedangkan T < 1 disebut fronting. Pra-filtrasi pelarut sebelum dimasukkan ke dalam sistem HPLC dan packing kolom yang tepat dengan fase diam murni dengan ukuran partikel yang tepat dapat mencegah masalah tailing secara signifikan. Injeksi dalam jumlah besar akan memperluas puncak,  sehingga sering kali menyebabkan fronting. Maka dari itu, volume injeksi sampel harus  sedikit.

Kolom HPLC

Packing material atau fase diam kolom HPLC dibasiskan pada polimer organik atau bahan keramik anorganik. Di luar dari keramik anorganik, bahan alumina dan silika adalah yang paling umum diminati. Packing anorganik memiliki kekakuan tinggi dan tidak dapat mengembang dalam pelarut apa pun. Metakrilat dan stirena divinilbenzena yang berikatan silang menjadi basis polimerik packing grade-HPLC. Pilihan yang paling baik yaitu packing polimerik tidak kaku seperti packing anorganik.

Klasifikasi Fase Diam Kolom HPLC:

● NP-HPLC (fase normal)

Partikel silika kecil dalam kolom sebagai fase diam polar dan pelarut nonpolar (misalnya kloroform) sebagai fase gerak digunakan dalam NP-HPLC. Senyawa nonpolar dalam campuran bergerak cepat dengan tekanan tinggi melalui kolom, sedangkan senyawa polar tinggal lebih lama.

● IEC-HPLC [ion-exchange chromatography] (fase ion-exchange)

HPLC ion-exchange memisahkan ion/molekul polar. Gugus fungsi ionik yang terdapat pada konstituen fase diam berinteraksi dengan analit bermuatan yang berlawanan. Kromatografi pertukaran kation dapat digunakan ketika molekul target bermuatan positif.

● RP-HPLC (fase terbalik)

HPLC fase terbalik adalah metode HPLC yang paling umum diterapkan. Partikel silika polar diberikan gugus nonpolar dengan memodifikasi permukaan dengan rantai alkil yang panjang (8–18 C). Pelarut polar (misalnya, campuran air-metanol) yang bertindak sebagai fase gerak digunakan. Oleh karena itu, senyawa polar bergerak lebih cepat dibandingkan senyawa nonpolar karena afinitasnya yang tinggi terhadap pelarut polar. Senyawa nonpolar bertahan lebih lama dikarenakan fase diam nonpolar membentuk ikatan lemah seperti gaya tarik van der Waals, momen dipol, ikatan hidrogen lemah, dll.

● SEC-HPLC [size-exclusion chromatography] (fase eksklusi ukuran)

Kromatografi eksklusi ukuran (SEC), juga disebut kromatografi saringan molekuler, memisahkan molekul berdasarkan ukurannya dan juga terkadang berdasarkan berat molekul dengan filtrasi gel. Ketika larutan aqueous melewati kolom fase diam (misalnya dekstrin, pati), maka gel akan terbentuk. Difusi molekul tergantung pada ukuran pori gel. Saat melewati kolom, molekul yang lebih kecil dengan cepat melewati kolom, dan molekul yang lebih besar dari pori tertahan dan dielusi sebagai volume kosong.

Kolom RP-HPLC berbasis silika lebih diminati dikarenakan kelebihan berikut:

• Lebih reproducible dan lebih cepat dibandingkan dengan mode HPLC lain
• Relatif lebih mudah untuk eksperimen
• Cakupan aplikasi lebih luas dengan sampel rentang polaritas luas
• Memanfaatkan fase gerak dengan biaya terjangkau
• Aplikasinya mencakup pemisahan senyawa organik terionisasi atau ionik. Hal ini dilakukan dengan menggunakan teknik ion pairing mode (IPC).
• Penggunaan 70–80% dari semua aplikasi HPLC

Packing Material: Silika

Silika memiliki afinitas tinggi terhadap air, sehingga menyebabkan perubahan karakteristik kromatografi setelah hidrasi. Hal ini menjadikan reprodusibilitas analisis dari packing silika tidak semudah packing lainnya. Dikarenakan permukaan NP-HPLC (NPC, normal phase chromatography) bersifat polar, pelarut yang digunakan harus bersifat nonpolar dan non-air untuk meningkatkan kekuatan elusi, yaitu polaritas eluen harus ditingkatkan.

Packing silika untuk kolom HPLC merupakan partikel silika berpori kecil dengan bentuk bulat atau tidak beraturan berdiameter 3, 5 atau 10 µm. Packing ini diproduksi sedemikian rupa sehingga memiliki ukuran partikel kecil dan distribusi ukuran pori sempit. Silika sangat larut dalam larutan pH > 7,5 dan < 2,6.

Penggunaan silika secara terus-menerus dapat menyebabkan sebagian kecil packing tersapu keluar dari kolom, sehingga munculnya rongga dalam jangka waktu tertentu. Selama penyimpanan, kolom packing silika mampu mengalami perubahan secara cepat dalam sifat kromatografi sehingga harus dikondisikan oleh fase gerak sebelum digunakan.

Silika: Bahan Dasar Packing Material HPLC

Struktur silika gel yang digunakan untuk kromatografi berbentuk amorf (irregular) dan juga merupakan bentuk berpori silikon dioksida (SiO2). Struktur ini terdiri dari framework tridimensi tak seimbang yang mengubah atom oksigen dan silikon, menghasilkan rongga dan pori-pori berukuran nanometer. Rongga-rongga tersebut dapat berisi gas, air atau cairan. Salah satu ciri utama permukaan silika adalah gugus silanol (SiOH). Ikatan di antara silika dan hubungannya dengan air relatif kompleks, sehingga sulit untuk menentukan struktur silika secara tepat, karena silika dianggap sebagai polimer hidup dibandingkan bahan dengan struktur tetap.

Fase diam berbasis silika adalah yang paling umum digunakan dalam HPLC. Partikel silika gel tersedia secara komersial dalam berbagai ukuran dan porositas. Namun silika gel tidak stabil pada kondisi pH ekstrim. Misalnya, silika gel larut pada pH<2. Pada pH>8, ikatan siloksan yang menghubungkan fungsi kimia dengan silika terdisosiasi.

RP-HPLC Berbasis Silika (Bonded Silica)

Dalam packing bonded silica (atau RP-HPLC) untuk kolom, sifat sorpsi (pembuangan senyawa dari larutan) dari silika telah dimodifikasi. RP-HPLC atau RPC (reversed-phase chromatography) menunjukkan fase dimana fase diam memiliki polaritas yang lebih rendah dibandingkan dengan fase gerak yang bertolak belakang dengan NPC (normal-phase chromatography). Packing RP-HPLC dihasilkan dengan mereaksikan partikel silika (permukaan polar) dengan organo-klorosilan dalam wujud umum Si(CH3)2RCl, dimana R melambangkan gugus fungsi hidrofobik. Gugus R pada dasarnya dapat dimodifikasi untuk mengubah polaritas silika. Dalam jenis paling umum dimana fase diam nonpolar mengandung gugus R dengan rantai hidrokarbon C18 (n-oktildesil) atau C8 (n-oktil), dimana kedua jenis kolom merupakan kolom yang paling banyak digunakan.

Untuk memastikan tidak ada interaksi yang tidak diinginkan antara zat terlarut dan sisa gugus -SiOH, penambahan Si(CH3)3Cl dilakukan demi membantu dalam konversi situs yang tidak bereaksi menjadi SiOSi(CH3)3. Jenis kolom ini adalah end-capped. Proses end-capping didasarkan pada penggunaan reagen silan yang lebih kecil atau tidak terlalu mengganggu seperti trimetilsilana. Populasi sisa gugus silanol dengan end-capping menghasilkan peningkatan kinerja packing RP.

Tabel 2. Modifikasi kimia gugus silanol pada permukaan silika dalam RP-HPLC Berbasis Silika (Bonded Silica)

Seleksi Kolom HPLC

Seleksi kolom yang tepat menghasilkan pemisahan dan kuantifikasi senyawa dalam HPLC secara akurat. Seleksi kolom tergantung pada kimia fase diam, ukuran partikel fase diam, dimensi kolom, waktu retensi, dan suhu. Suatu kolom dapat mengandung fase diam seperti polimer, zirkonium, alumina, silika, silika termodifikasi permukaan, dan lain sebagainya. Bahan-bahan ini memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Partikel silika memiliki banyak keuntungan yang mencakup biaya rendah, mudah untuk dikonversi menjadi partikel spheris seragam, tahan terhadap tekanan tinggi, serta cakupan aplikasi yang luas. Akan tetapi, kelemahan silika yang signifikan adalah larut dalam pH basa. Untuk mengatasi kelemahan tersebut, modifikasi yang dapat menahan pH basa telah dikembangkan. Sebagian besar pemisahan fase terbalik, kolom C18 (n-oktildesil) merupakan pilihan yang paling banyak diminati. Kolom sistem yang digunakan pada suhu 30-40 °C menunjukkan hasil yang baik dan reproducible.

Kolom HPLC COSMOSIL Nacalai Tesque

COSMOSIL C18: Standard Reversed Phase Columns

Kolom RP-HPLC (fase terbalik) merupakan kolom yang paling banyak digunakan karena indeks efisiensi (atau theoretical plate number, N) tinggi, karakteristik pemisahan unggul, reprodusibilitas tinggi, terjangkau dan mudah digunakan. Jenis packing kolom berupa silica gel bondend oktadesil (C18, ODS) adalah yang paling banyak diminati untuk kegiatan laboratorium quality control dan penelitian. Nacalai menawarkan beberapa kolom COSMOSIL tipe berikut:

• C18-MS-II – dapat digunakan untuk berbagai macam jenis senyawa
• 3C18-EB – untuk senyawa basa (tailing peaks)
• C18-AR-II – untuk senyawa asam dan peptida
• C18-PAQ – untuk senyawa sangat polar (100% Air MP, Microfiltration Plus)

Jika kolom C18 tidak bekerja dengan baik dalam pengujian laboratorium, beberapa solusi dapat diaplikasikan untuk membantu mengatasi masalah tersebut, yaitu dengan mengubah panjang panjang kolom (meningkatkan kapasitas), mengubah fase gerak dan mengubah sifat kimia kolom. Peningkatan ukuran kolom C18 akan meningkatkan waktu retensi sehingga kolom bekerja dengan baik dan hasil data peak lebih jelas. Penurunan konsentrasi organik dapat juga menyebabkan waktu retensi lebih panjang pada RP-HPLC, misalnya penurunan konsentrasi metanol dari 90% ke 60% untuk mendapatkan peak yang terpisah secara jelas. Alternatif lainnya yakninya mengubah pola pemisahan dengan menggunakan interaksi molekul-molekul yang berbeda.

Gambar 1. Penurunan konsentrasi metanol untuk perpanjangan waktu retensi (sumber: Nacalai Tesque).

Kolom Unggulan COSMOSIL 1.8C18-MS-2

Dikarenakan silika memiliki pori-pori pada seluruh strukturnya, silika dapat berinteraksi dengan sampel pada area permukaan yang sangat luas. Saat jumlah fase oktadesil yang dapat diikat meningkat, sampel hidrofobik dapat ditahan lebih lama, sehingga meningkatkan proses pemisahan pada sistem HPLC. Dengan hidrofobisitas dan selektivitas tinggi, 1.8C18-MS-II mampu memisahkan senyawa yang sulit dipisahkan, misalnya pemisahan antara asam asetilsalisilat, loksoprofen, ketoprofen, naproksen, fenilbutazon, celecoxib, diklofenak dan indometasin.

Kolom Spesifik : COSMOSIL Reversed Phase Specialty Columns

• COSMOSIL Cholester – untuk senyawa alami, vitamin, katekin dan narkotika (con. Vitamin D2/D3)
• COSMOSIL PBr – untuk senyawa polar (RPC) dan vitamin larut air (con. nukleotida: AMP / ADP / ATP)
• COSMOSIL πNAP – untuk isomer posisional dan struktural (con. isomer Tolunitril)
• COSMOSIL HILIC – untuk senyawa polar, taurin, GABA, melamin dan metilimidazol
• COSMOSIL PFP – untuk vitamin E, isomer struktural dan senyawa terhalogenasi
• COSMOSIL Sugar-D – untuk sakarida (mono-, di-, tri- etc)

Gambar 2. Pemisahan dengan COSMOSIL PBr menghasilkan data resolusi peak yang lebih baik untuk pemisahan nukleotida (sumber: Nacalai Tesque).

Masalah-Masalah Output Data HPLC

Berikut kami deskripsikan beberapa masalah HPLC umum yang dapat terjadi selama aktivitas teknik HPLC:

– Pemisahan Peak

Peak terpecah menjadi beberapa puncak yang lebih kecil, sehingga mempengaruhi resolusi yang biasanya disebabkan  oleh beban berlebih pada kolom, packing kolom tidak baik, atau konsentrasi sampel berlebihan. Solusi terbaik yaitu mengurangi konsentrasi sampel atau gunakan kolom berkapasitas lebih tinggi (ukuran lebih panjang).

– Tailing Peak

Peak mempunyai bentuk tailing (asimetris) yang disebabkan oleh interaksi dengan sisa silanol pada permukaan kolom, pengaruh pH atau interaksi sekunder. Solusi terbaik dengan melakukan optimalisasi pH fase gerak, penggunaan kolom deaktivasi basa, atau penambahan agensi ion-pairing. Kolom monomer dan end-capped seperti COSMOSIL 3C18-EB akan menghasilkan bentuk peak yang lebih baik dan tidak tailing untuk senyawa basa.

– Peak Fronting

Peak terlalu sempit dan menghadap ke depan yang diakibatkan oleh suhu kolom terlalu tinggi, adsorpsi kuat, atau kelarutan sampel buruk. Penurunan suhu kolom, penggunaan kolom tidak terlalu hidrofobik, atau peningkatan kelarutan sampel dapat menjadi solusi masalah berikut.

– Ketidakstabilan Baseline

Fluktuasi atau penyimpangan baseline dapat terjadi akibat gelembung udara, kotoran fase gerak, atau kebisingan detektor.

– Pergeseran Waktu Retensi

Peak terelusi lebih awal atau lebih lambat dari yang semestinya. Hal ini umumnya disebabkan oleh perubahan komposisi fase gerak, kolom yang sudah lama (penurunan kinerja atau tidak baru), atau variasi suhu.

Referensi:

1. Nacalai Tesque: COSMOSIL® Columns
2. Pharmacokinetics: Basics to Applications Front Cover Biswajit Mukherjee Springer Nature, 2022.
3. Introduction to Basics of Pharmacology and Toxicology: Volume 1: General and Molecular Pharmacology: Principles of Drug Action Front Cover Gerard Marshall Raj, Ramasamy Raveendran Springer Nature Singapore, 2019.
4. High Performance Liquid Chromatography: Theory, Instrumentation and Application in Drug Quality Control. Omar Al Sayed Omar, Moustafa A. Khalifa. Walter de Gruyter GmbH & Co KG, 2022.