Hasil dari analisis In Silico, seperti molecular docking dan molecular dynamic simulation (MDS), dapat memberikan dasar yang kuat dan mendukung untuk berbagai jenis pengujian laboratorium basah seperti ELISA, SDS-PAGE, dan Western Blot.

Berdasarkan penjelasan materi dari Prof. drg. Endang Winiati Bachtiar, M.Biomed., Ph.D., PBO dan Bapak Turmidzi Fath, M.Sc., M.Si dari Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia bahwa molecular docking membantu memprediksi bagaimana ligan (misalnya senyawa obat) berinteraksi dengan target protein. Uji MDS memperbaiki hasil docking dengan memperhitungkan sistem yang dinamis sehingga memastikan stabilitas interaksi ligan-protein dalam lingkungan yang lebih realistis.

Hasil docking dan MDS dapat menunjukkan potensi interaksi antara protein target dan ligan. ELISA dapat digunakan untuk mengkonfirmasi interaksi ini. Kemudian, pengujian SDS-PAGE dapat digunakan untuk memverifikasi apakah ligan mempengaruhi stabilitas atau konformasi protein target. Western Blot dapat digunakan untuk mendeteksi dan memberikan data kuantifikasi ekspresi protein target yang berinteraksi dengan ligan, seperti yang diprediksi oleh docking. Hasil MDS dapat memberikan informasi tentang perubahan konformasi atau modifikasi pasca-translasi yang dapat diverifikasi menggunakan antibodi spesifik dalam proses Western Blot.

Bag 2 – Workshop pengujian Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Penyampaian materi ELISA disampaikan oleh Prof. drg. Endang Winiati Bachtiar, M.Biomed., Ph.D., PBO, kemudian dilanjutkan dengan hands-on para peserta Workshop dengan bimbingan Prof. Endang dan tim FKG UI.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) adalah metode yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi protein, peptida, antibodi, atau hormon dalam sampel. Prinsip dasar ELISA melibatkan pengikatan spesifik antara antigen dan antibodi, yang kemudian dideteksi melalui reaksi enzimatik yang menghasilkan perubahan warna.

Ada beberapa variasi dari ELISA berdasarkan dengan prinsip yang berbeda yaitu direct ELISA, indirect ELISA, competitive ELISA, dan sandwich ELISA.

1. Direct ELISA adalah salah satu metode ELISA yang paling sederhana, dimana antigen diadsorpsi langsung ke permukaan well, kemudian diikuti oleh deteksi menggunakan antibodi spesifik yang terkonjugasi dengan enzim, dan menghasilkan perubahan warna. Intensitas warna ini diukur menggunakan spektrofotometer dan sebanding dengan jumlah antigen yang terikat.Direct ELISA adalah metode sederhana dan cepat untuk mendeteksi dan mengukur antigen spesifik dalam sampel, meskipun memiliki beberapa keterbatasan dalam hal sensitivitas dan risiko pengikatan non-spesifik.
2. Indirect ELISA adalah metode ELISA yang melibatkan dua tahap pengikatan yaitu pertama antigen diikat oleh antibodi primer, kemudian antibodi primer tersebut dideteksi oleh antibodi sekunder yang terkonjugasi dengan enzim. Substrat enzim yang ditambahkan akan menghasilkan perubahan warna. Indirect ELISA adalah metode yang lebih sensitif dan fleksibel dibandingkan direct ELISA, dengan kemampuan untuk mendeteksi dan mengukur antibodi spesifik dalam sampel.
3. Sandwich ELISA adalah metode ELISA yang sangat sensitif dan spesifik untuk mendeteksi dan mengukur antigen dalam sampel. Dalam metode ini, antigen diapit (posisi sandwich) antara dua lapisan antibodi yaitu antibodi penangkap (capture antibody) dan antibodi pendeteksi (detection antibody).Meskipun prosesnya lebih kompleks, sandwich ELISA banyak digunakan dalam berbagai aplikasi diagnostik, penelitian biologi molekuler, dan maupun industri. Pemilihan antibodi penangkap dan pendeteksi yang tepat serta optimalisasi kondisi assay sangat penting untuk mencapai hasil yang akurat.
   

   Gambar 1. Prinsip Direct ELISA, Indirect ELISA, dan Sandwich ELISA

4. Competitive ELISA adalah metode ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur antigen dalam sampel berdasarkan kompetisi antara antigen dalam sampel dengan antigen ter-label atau antigen standar untuk mengikat antibodi.

Gambar 2. Prinsip Competitive ELISA

A. Tahapan pengerjaan metode ELISA

Sebelum memulai proses pengerjaan ELISA, peneliti harus memilih jenis biomarker yang akan digunakan karena kit ELISA yang akan digunakan spesifik hanya untuk 1 marker. Setelah melakukan pemilihan marker dan membeli ELISA Kit, peneliti perlu memperhatikan protokol manual ELISA Kit tersebut seperti pada Gambar 3.

Gambar 3. Protokol Manual Human IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit dari Elabscience

Pada protokol manual akan tertera informasi bahwa benar marker yang digunakan sesuai dengan packaging yaitu Human IL-6, kemudian prinsip metode ELISA yang digunakan adalah Sandwich ELISA, dan hasil absorbansi (OD) menggunakan spektrofotometri/ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Di dalam protokol manual juga terdapat informasi komponen kit yang akan didapatkan oleh peneliti, proses pengenceran sampel, preparasi reagent, dan prosedur pengujian ELISA.

Berikut prosedur pengujian Sandwich ELISA :

1. Tambahkan 100 µL standar atau sampel ke dalam well Inkubasi selama 90 menit pada suhu 37°C.
2. Buang cairan, segera tambahkan 100 µL Biotinylated Detection Ab working solution ke well. Inkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C.
3. Lakukan pencucian sebanyak 3 kali.
4. Tambahkan 100 µL HRP Conjugate working solution. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Lakukan pencucian sebanyak 5 kali.
5. Tambahkan 90 µL substrat. Inkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C.
6. Tambahkan 50 µL Stop Solution.
   

   Gambar 4. Peserta Workshop memberikan Stop Solution

7. Segera membaca ELISA plate pada Spektrofotometri / ELISA reader pada gelombang 450 nm. Kemudian akan didapatkan hasil absorbansi (OD) dan perhitungan hasil.

B. Troubleshooting proses ELISA

Dalam proses pengerjaan ELISA, berbagai masalah dapat terjadi yang dapat mempengaruhi keakuratan dan hasil. Berikut adalah troubleshooting yang sering dihadapi, serta rekomendasi untuk mengatasi dan mencegah masalah tersebut :

1. Standard kurva yang kurang baik biasanya dikarenakan beberapa hal termasuk teknik pipetting dan teknik pembuatan kurva. Gunakan pipet yang telah dikalibrasi dengan pemipetan yang konsisten. Pastikan bahwa standar diukur dengan benar dan pembuatan kurva dilakukan dengan hati-hati.
   

   Gambar 5. Peserta Workshop melakukan Teknik Pipetting dan Teknik Pengenceran

2. Nilai Coefficient of Variation (CV) yang tinggi menunjukkan variabilitas tinggi antara replikasi. Salah satu penyebabnya ada dalam teknik pipetting. Latih teknik pipetting yang konsisten dan gunakan pipet yang sesuai dengan volume yang akan dipipet dan pastikan volume pipet sesuai dengan kebutuhan.
3. Nilai R-squared (regresi) tidak mencapai 1, menunjukkan ketidaksesuaian antara data kurva standar dan model. Kemungkinan penyebabnya yaitu terkait teknik pipetting dan  suhu penyimpanan reagen.
4. Konsentrasi target sampel terlalu tinggi menyebabkan hasil di luar jangkauan kurva standar. Salah satu penyebabnya yaitu sampel terlalu pekat. Lakukan optimasi dan pengenceran sampel sebelum analisis untuk memastikan konsentrasi antigen berada dalam rentang kurva standar.
5. Well yang masih basah setelah washing dapat menyebabkan kontaminasi atau hasil yang tidak akurat. Pastikan untuk mencuci well dengan buffer pencuci secara menyeluruh dan pastikan bahwa tidak ada sisa buffer yang tertinggal.
   

   Gambar 6. Demo Tim FKG UI teknik washing yang baik dan benar

6. Penyimpanan ELISA Kit yang tidak sesuai atau paparan cahaya yang berlebihan dapat mempengaruhi kualitas dan efektivitas reagen. Simpan reagen sesuai dengan protokol, biasanya di suhu dingin (misalnya 4°C) dan jauh dari cahaya langsung. Gunakan ELISA Kit sebelum tanggal expired.

C. Standard Kurva dan Hasil Konsentrasi ELISA

• Kurva standar pada competitive ELISA adalah kurva inhibisi, nilai absorbansi berbanding terbalik dengan konsentrasi antigen dalam sampel. Semakin tinggi konsentrasi antigen dalam sampel, semakin rendah sinyal yang dihasilkan.
• Kurva standar pada sandwich ELISA adalah kurva saturasi, nilai absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi antigen dalam sampel. Semakin tinggi konsentrasi antigen dalam sampel, semakin tinggi sinyal yang dihasilkan. Kurva standar sandwich ELISA biasanya menunjukkan peningkatan sinyal seiring peningkatan konsentrasi antigen hingga mencapai titik jenuh.

Gambar 7. Kurva Standard Competitive ELISA pada kit Elabscience

Gambar 8. Kurva Standard Sandwich ELISA pada kit Elabscience

Produk ELISA Kit dapat dilihat pada website Elabscience berikut : https://www.elabscience.com/ Spesifikasi detail yang user / peneliti butuhkan bisa menghubungi sales PT. Indogen langsung melalui WhatsApp berikut : List ELISA Kit Elabscience

Bag 3 – Workshop Western Blot 101

Pemaparan materi Western Blot oleh drg. Rizky Aditya Irwandi, M.Sc dari Lab Oral Biologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia.

Gambar 9. Pemaparan Materi Western Blot 101 oleh drg. Rizky Aditya Irwandi, M.Sc

Artikel terkait Proses Western Blot yang sudah diulas oleh PT. Indogen Intertama :

• Mengenal Western Blot Bersama Solarbio Life Science
• Prinsip Kerja Western Blotting (WB) dan Komponen yang Dibutuhkan: Preparasi – Bagian 1
• Prinsip Kerja Western Blotting (WB) dan Komponen yang Dibutuhkan: Elektroforesis – Bagian 2
• Protein Electrophoresis

A. Prinsip Pengujian Western Blot

Western blot  merupakan metode untuk mendeteksi antibodi  spesifik pada suatu protein dengan berat molekul tertentu yang telah diseparasi. Pada awalnya,  berat  molekul  protein  diseparasi  atau  dipisahkan  dengan menggunakan  SDS-PAGE elektroforesis. Pada dasarnya prosedur dari Western blot adalah Gel SDS-PAGE ditransfer ke  membrane Nitrocellulose,  selanjutnya  immunostaining  (Blocking Non spesifik,  inkubasi antibody  primer, inkubasi  antibody  sekunder, dan penambahan substrat. Identifikasi berat molekul sampel dengan cara membandingkan marker/band yang berpendar pada membran nitroselulosa sejajar dengan marker.

B. Tahapan bagian I proses Pra-Western Blot Proses

Berikut adalah tahapan proses Western Blot bagian 1 :

1. Protein Extraction dengan RIPA Buffer, untuk memastikan lisis sel yang sempurna. Collect supernatan yang mengandung protein total dalam mikrotube baru, hindari pellet yang mengandung debris seluler.

Produk RIPA Buffer yang dapat PT. Indogen Intertama supply yaitu :

2. Kuantifikasi Protein dengan Bradford Assay

Bradford assay digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam sampel dalam waktu singkat (biasanya kurang dari 10 menit). Metodenya mudah dilakukan dengan sedikit langkah yaitu menambahkan reagent ke sampel yang menyebabkan perubahan warna pengukuran absorbansi.

Intensitas warna biru yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi protein dalam sampel. Pembuatan kurva standar untuk menghitung konsentrasi protein dalam sampel berdasarkan absorbansi yang diukur.

Produk Bradford Assay Kit yang dapat PT. Indogen Intertama supply yaitu :

3. Preparasi Sampel, dengan Laemmli Sample Buffer dan Beta-Mercaptoethanol

Penggunaan Laemmli buffer yang mengandung SDS dan zat reduksi (beta-mercaptoethanol atau DTT) berfungsi untuk memastikan protein terdenaturasi dan bermuatan negatif. Lakukan pemanasan sampel untuk denaturasi penuh sebelum elektroforesis dan sampel siap dirunning.

Produk Sample Buffer Solution yang dapat PT. Indogen Intertama supply yaitu :

C. Tahapan bagian II Protein Separation SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan metode yang digunakan untuk mengetahui berat molekul dari suatu protein. Katoda dan anoda sangat penting dalam proses SDS-PAGE karena mereka menciptakan medan listrik yang mempengaruhi migrasi protein melalui gel poliakrilamida.

Gambar 10. Pengerjaan Protein Separation SDS-PAGE

Gambar 11. Ilustrasi proses SDS-PAGE

Medan listrik antara katoda dan anoda memastikan bahwa protein bermigrasi dari well di dekat katoda menuju anoda, memungkinkan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul.

C.1 Tahapan Separasi Protein SDS-PAGE

a. Setting PreCast Gel Acrylamide Kit,
isi chamber bagian atas dan bawah dengan buffer running hingga mencapai level yang sesuai. Pasang gel precast ke dalam perangkat dan isi buffer chamber. Sudah terdapat PreCast Gel yang dapat digunakan ready to use sehingga dapat memudahkan peneliti, seperti pada produk yang PT.

Indogen Intertama supply berikut :

b. Loading dan Running SDS-PAGE
Setelah menyiapkan sampel, sampel dan marker di pipette ke sumur gel, kemudian jalankan elektroforesis. Jangan lupa menempatkan protein marker ke dalam sumur yang terpisah untuk ukuran referensi. Jalankan elektroforesis pada tegangan yang sesuai sampai pewarna bromophenol blue mencapai bagian bawah gel.

c. Visualisasi Hasil
Setelah proses running selesai, gel dapat difoto menggunakan Gel Doc, Gel yang digunakan pada workshop kali ini menggunakan teknologi stain-free sehingga visualisasi lebih cepat.

Jika menggunakan pewarnaan gel (Coomassie stain) setelah elektroforesis selesai, lepaskan gel dari perangkat. Tempatkan gel dalam larutan pewarna Coomassie Brilliant Blue selama 1-2 jam atau semalaman. Setelah itu tempatkan gel dalam larutan destaining hingga latar belakang gel menjadi jernih dan pita protein terlihat jelas.

Produk Coomassie Solution yang dapat PT. Indogen Intertama supply yaitu :

Gunakan sistem imaging untuk memindai gel dan mendeteksi protein. Sistem ini menggunakan cahaya UV dan menghasilkan sinyal fluoresen yang dapat dideteksi oleh kamera. Hasil identifikasi pita protein berdasarkan ukuran molekul dengan membandingkan dengan marker protein.

C.2 Troubleshooting SDS-PAGE

Dalam proses pengerjaan SDS-PAGE, terdapat beberapa rekomendasi dari tim FKG UI yang perlu diperhatikan sebagai berikut :

• Handling Precast Gel secara hati-hati
  Gel bisa robek selama penanganan, pemasangan, atau pelepasan dari casing. Peneliti dapat menggunakan spatula atau penjepit yang tidak tajam untuk memindahkan gel.

• Memastikan Gel tetap basah
  Selalu pastikan gel tetap dalam buffer atau dibasahi dengan buffer ketika tidak digunakan. Gel dapat disimpan dalam wadah tertutup yang berisi sedikit buffer jika perlu menghentikan proses sementara.

• Memastikan Buffer tidak bocor pada chamber SDS-PAGE
  Kebocoran buffer dapat menyebabkan sistem tidak berfungsi dengan baik dan mempengaruhi hasil pemisahan protein. Sebelum mulai menjalankan elektroforesis, pastikan tidak ada kebocoran pada buffer chamber. Isi buffer secara bertahap dan periksa kebocoran.
• Hindari kontaminasi antar well
  Kontaminasi antar well dapat menghasilkan hasil yang tidak akurat dan sulit diinterpretasikan. Salah satu penyebabnya yaitu perlunya teknik pipetting yang akurat dan hati-hati ketika memuat sampel ke dalam well.

D. Tahapan bagian III Metode Transfer Membran pada Proses Western Blot

Terdapat beberapa metode transfer membran  dalam proses Western Blot untuk memindahkan protein dari gel poliakrilamid ke membran (biasanya membran nitroselulosa atau PVDF). Metode ini mencakup wet transfer, semi-dry transfer, dan dry transfer.

a. Wet Transfer

Wet transfer menggunakan buffer transfer dalam jumlah besar untuk memindahkan protein dari gel ke membran menggunakan arus listrik. Wet Transfer merupakan metode yang efektif untuk berbagai ukuran protein, tetapi memakan waktu lebih lama dibandingkan metode lainnya.

b. Semi-dry Transfer

Semi-dry transfer menggunakan sedikit buffer dan elektroda yang ditempatkan langsung pada gel dan membran. Metode semi-dry transfer menggunakan perangkat transfer semi-dry dengan elektroda atas dan bawah. Kelebihan dari metode ini yaitu waktu transfer lebih singkat dibandingkan wet transfer dan menggunakan buffer lebih sedikit.

c. Dry Transfer

Metode Dry Transfer menggunakan perangkat sistem transfer kering dengan membran dan kertas filter khusus. Komponen sandwich diletakkan dalam perangkat transfer kering dengan arus listrik selama 5-10 menit. Kelebihan dari metode ini yaitu proses yang sangat cepat dan mudah digunakan.

Gambar 12. Ilustrasi sandwich dan proses transfer membrane Western Blot

E. Tahapan bagian IV Immunostaining

Tahapan immunostaining adalah tahap pewarnaan protein yang akan dianalisis dari sekumpulan protein yang telah terpisah dan tertransfer ke membran. 3 proses penting dalam staining yaitu : Blocking – inkubasi antibody  primer – inkubasi  antibody  sekunder.

• Blocking buffer akan memblok permukaan membran yang tidak dilekati protein pasca transfer dari gel
• Antibodi primer akan mendeteksi protein yang akan dianalisis tapi tidak bisa tervisualisasikan.
• Antibodi sekunder akan menandai protein yang sudah dilekati antibodi primer agar dapat divisualisasikan. Antibodi sekunder terkonjugasi enzim atau fluorofor untuk visualisasi hasil pendeteksian antibodi primer.

Produk antibodi primer dan antibodi sekunder untuk aplikasi Western Blot dapat dilihat pada website Elabscience berikut : https://www.elabscience.com/ . Spesifikasi detail yang user / peneliti butuhkan bisa menghubungi sales PT. Indogen langsung melalui WhatsApp berikut : +62 812-9318-5185.

F. Tahapan bagian V Visualization Hasil

Visualisasi hasil proses pewarnaan dapat menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, fluorescence, dan radioaktif. Metode visualisasi bisa disesuaikan dengan kebutuhan user.

Kolorimetri menawarkan metode sederhana dan stabil, chemiluminescent memberikan sensitivitas tinggi, fluorescence memungkinkan multiplexing dan spesifisitas tinggi, sedangkan radioaktif memberikan sensitivitas yang sangat tinggi tetapi dengan pertimbangan keselamatan yang lebih ketat.

Sebagai dokumentasi, Anda dapat mengambil gambar hasil menggunakan gel imager, kamera digital, atau scanner. Peneliti juga bisa menganalisis ketebalan pita protein berdasarkan ukuran dan intensitasnya menggunakan software analisis gambar jika diperlukan.

Gambar 13. Bagian Kiri adalah Proses Membran Transfer, dan Bagian Kanan adalah Hasil Visualisasi Western Blot menggunakan Kolorimetri

Gamba4 14. Hasil Visualisasi Western Blot oleh team Nacalai Tesque Japan

G. Troubleshooting Western Blot

Dalam proses pengerjaan Western Blotting terdapat beberapa rekomendasi dari tim FKG UI yang perlu diperhatikan sebagai berikut :

1. Perlunya teknik Pipetting yang baik dan benar, hindari gelembung udara dan memipet secara perlahan untuk mencegah overflow dan kontaminasi antar well.
2. Perlunya Teknik Pengenceran / Dilution, dengan memastikan semua larutan tercampur dengan baik dengan menggunakan vortex.
3. Handling Gel dengan cepat, penanganan gel yang lambat dapat menyebabkan protein menyebar dan menghasilkan pita yang tidak tajam.
4. Memperhatikan urutan sandwich pada Transfer Membran.
   Kesalahan dalam urutan sandwich dapat menyebabkan gagalnya transfer protein, hindari gelembung udara dengan menggunakan roller atau falcon tube untuk menghilangkan gelembung udara antara gel dan membran.

5. Pemilihan Antibodi Primer dan Antibodi Sekunder yang Tepat
   Pastikan antibodi primer sesuai dengan dari spesies mana protein yang akan dianalisis berasal. Kemudian pastikan antibodi sekunder sesuai dengan dari spesies mana sumber antibodi primer berasal.

6. Penggunaan standar protein (protein ladder) sesuai dengan kebutuhan visualisasi protein yang akan dianalisis. Penggunaan protein ladder akan mempengaruhi tipe Gel dan buffer yang akan digunakan oleh peneliti.

Gamba4 14. Hasil Visualisasi Western Blot oleh team Nacalai Tesque Japan

Dengan mengikuti langkah-langkah ini, Peneliti dapat meminimalkan masalah dan meningkatkan kualitas hasil Western Blot.