Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah salah satu metode dalam bidang laboratorium terutama imunologi untuk mengetahui ekspresi protein, reaksi imunitas, respon imun. Dalam bidang imunologi, teknik ELISA digunakan untuk menentukan adanya antigen atau antibodi dalam sampel/serum.Teknik ELISA banyak diaplikasikan dalam berbagai spesies baik human, rat, rabbit, mouse, tumbuhan dan lain-lain yang juga berfungsi sebagai alat diagnostik dalam bidang medis maupun non medis (research use only).

A. Protokol Preparasi Berbagai Macam Sampel Uji ELISA

Preparasi sampel yang tepat sangat penting untuk hasil yang akurat dalam uji ELISA. Sampel yang telah disiapkan dapat dikemas ulang dan disegel. Sangat penting untuk menghindari pencairan bebas yang berulang-ulang selama penyimpanan. Kondisi penyimpanan yang disarankan: 2 ~ 8 ℃ selama 5 hari; -20 ℃ selama 6 bulan; -80 ℃ selama 2 tahun.

Jenis sampel uji ELISA antara lain: darah (serum, plasma); homogenat jaringan; lisat sel; supernatan kultur sel; Cerebrospinal Fluid (CSF), Bronchoalveolar Lavage Fluid (BAL), and urine; saliva / urine / milk sample; dan lainnya.

Berikut adalah panduan umum untuk preparasi berbagai macam sampel untuk uji ELISA:

1. Sampel Serum

• Ambil sampel darah dalam tabung darah khusus yang mengandung antikoagulan, diamkan seluruh sampel darah selama 2 jam pada suhu ruang atau semalaman pada suhu 2-8℃
• Sentrifuge dengan kecepatan 3.000 rpm selama 10-15 menit, segera alikuot supernatan (serum) dan simpan sampel pada suhu -80°C sampai digunakan.

2. Sampel Plasma (Citric Acid, EDTA, Heparin)

• Ambil sampel darah ke dalam tabung EDTA, Citrate atau Heparin.
• Sentrifuge dengan kecepatan 3.000 rpm selama 10-15 menit dalam waktu 30 menit setelah pengumpulan.
• Lakukan pengujian segera atau alikuot dan simpan sampel pada suhu ≤ -20 °C.

3. Sampel Jaringan

• Umumnya, cincang jaringan menjadi potongan-potongan kecil dan bilas dengan PBS dingin (0,01M, pH=7,4) untuk menghilangkan kelebihan darah.
• Potongan jaringan harus ditimbang dan kemudian dihomogenisasi dalam PBS (berat jaringan (g): volume PBS (mL) =1:9) dengan homogenizer kaca di atas es.
• Pemecahan sel lebih lanjut menggunakan pengganggu sel ultrasonik atau melakukan siklus pembekuan-pencairan.
• Centrifuge selama 20 menit pada kecepatan 13.000 x rpm pada suhu 4°C.
• Letakkan di atas es, supernatan alikuot (ini adalah ekstrak protein larut) dan simpan sampel pada suhu -80°C.
• Untuk jaringan kulit (skin tissues), hilangkan lapisan lemak dan sedimen dasar setelah sentrifugasi. Ambil sampel lapisan tengah untuk dideteksi.

4. Sampel Sel Supernatan

• Kepadatan adherent cell atau suspension cell harus mencapai 60-90% dengan menggunakan pelat sumur 96/24/6
• Kepadatan adherent cell atau suspension cell harus mencapai 60-90% menggunakan cawan petri 6-10 mm.
• Ambil sampel suspension cell dan centrifuge pada 2500 rpm dengan suhu 2-8℃ selama 5 menit, kemudian kumpulkan supernatan kultur sel yang telah diklarifikasi.
• Pada adherent cell, ambil supernatan secara langsung; centrifuge pada 2500 rpm pada 2-8℃ selama 5 menit, kemudian kumpulkan supernatan kultur sel yang telah diklarifikasi. Segera lakukan pengujian atau simpan pada -80℃.

5. Sampel Cell Lysate pada Suspension Cell

• Sampel sel disentrifuge pada 2500 rpm pada 2-8℃ selama 5 menit, lalu kumpulkan selnya.
• Tambahkan PBS yang sudah didinginkan sebelumnya ke dalam sel yang terkumpul dan aduk perlahan.
• Centrifuge dengan kecepatan 2500 rpm pada suhu 2-8℃ selama 5 menit, lalu kumpulkan sel.
• Tambahkan 0,5-1 ml RIPA lysis buffer (medium). RIPA lysis buffer membutuhkan pH 7.3. Komponen yang mengandung NP -40 buffer lisis, surfaktan Triton X-100, atau DTT dengan konsentrasi lebih tinggi tidak disarankan karena akan mengganggu reaksi antigen-antibodi.
• Alternatifnya, gunakan 50 mM Tris+0,9% NaCL+0,1% SDS, pH 7,3. Tambahkan beberapa protease inhibitor (misalnya PMSF, konsentrasi: 1 mmol/L).
• Lisis sel di atas es selama 30 menit-1 jam, goyangkan tabung sentrifuge sesekali untuk melisiskan protein sepenuhnya.
• Pemecahan sel lebih lanjut menggunakan pengganggu sel ultrasonik, setelah itu centrifuge pada 10.000 rpm pada 2-8℃ selama 10 menit. Lalu, supernatan ditambahkan ke dalam tabung EP. Segera lakukan pengujian atau simpan pada suhu -80℃.

6. Sampel Cell Lysate pada Adherent Cell

• Ambil supernatan dan tambahkan pre-cooling PBS untuk mencuci tiga kali.
• Tambahkan 0,5-1 ml RIPA lysis buffer (medium) dan beberapa protease inhibitor (baca persyaratan dalam sel suspensi). Kikis sel yang menempel secara perlahan menggunakan pengikis sel.
• Tambahkan suspensi sel ke dalam tabung sentrifuge. Lisi sel di atas es selama 30 menit-1 jam.
• Pemecahan sel lebih lanjut menggunakan pengganggu sel ultrasonik, setelah itu centrifuge pada 10.000 rpm pada 2-8℃ selama 10 menit. Lalu, supernatan ditambahkan ke dalam tabung EP. Segera lakukan pengujian atau simpan pada suhu -80℃.
• Pemilihan cell lysate atau kultur sel supernatan sebagai sampel disesuaikan dengan posisi target objek.
• Jika target objek disekresikan (misalnya protein membran yang disekresi), kultur sel supernatan dapat digunakan sebagai sampel.
• Peneliti disarankan untuk memilih cell lysate untuk target objek intraseluler.

7. Sampel Saliva

• Beberapa hal yang harus diperhatikan untuk pengambilan sampel saliva yaitu : berpuasa dan berkumur 1 jam terlebih dahulu untuk menjaga kebersihan mulut. Tidak minum air putih dan menggosok gigi setengah jam sebelum pengambilan sampel.
• Ambil sampel saliva dengan menggunakan saliva collector dari Biolabware dengan no catalog BL-SC1000 Saliva Collector kit 10ml, sterilized, 1 pack isi 10.

Gambar 1. Biolabware BL-SC1000 Saliva Collector kit 10ml

• Centrifuge selama 2 menit pada 10.000 x g dengan suhu 2 -8℃. Atau centrifuge dengan kecepatan 2000-3000 rpm selama 20 menit. Sampel air liur segar direkomendasikan untuk pengujian.

8. Sampel Urine

• Ambil urin pertama hari itu secara aseptik (pertengahan aliran urin).
• Untuk mendeteksi urin manusia, sampel dengan nilai uji tinggi harus diencerkan sebanyak 5 kali.
• Centrifuge selama 2 menit pada 10.000 x g dengan suhu 2 -8℃. Atau centrifuge dengan kecepatan 2000-3000 rpm selama 20 menit. Segera lakukan pengujian atau simpan pada suhu -80℃.

9. Sampel Susu

• Gunakan tabung steril untuk mengambil sampel susu.
• Centrifuge selama 2 menit pada 10.000 x g dengan suhu 2 -8℃. Atau centrifuge dengan kecepatan 2000-3000 rpm selama 20 menit.
• Pada sampel ASI, hilangkan lapisan lemak dan sedimen bawah setelah sentrifugasi. Ambil sampel lapisan tengah untuk deteksi atau simpan pada suhu -80℃.

Gambar 2. Datasheet ELISA kit merk Elabscience

Sebagai contoh kita ambil dari kit Elabscience E-EL-H6156 Human IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit dengan informasi jenis sampel dan volume yang dibutuhkan.

B. ELISA Plate Map

ELISA Plate pada dasarnya adalah template dari 96 sumur pada ELISA plate standar. Dengan 96 sumur, masing-masing berisi sampel individual, sangat penting untuk melacak dengan tepat apa yang telah ditempatkan di setiap sumur.  Seperti pada semua pengujian ELISA, semua standar, sampel, dan blanko digandakan dengan ELISA pengenceran serial. Biasanya, 96 sumur terdiri adalah sumur standar dan 80 sel sisanya berisi 40 sampel (masing-masing digandakan duplo).

Gambar 3. Desain ELISA Plate

C. ELISA Kit dari brand Elabscience dan Finetest

Indogen Intertama menyediakan produk yang mendukung lini pengerjaan ELISA immunoassay meliputi reagent Quantikine dari brand Elabscience dan Finetest dan 96-well microplate untuk manual coating dari brand JetBiofil.

Gambar 4. Microwell Plates 96-well, Dnase/Rnase-free, Sterilized merk JetBiofill

Tabel 1. Elabscience® dan Finetest ELISA Kit

Baca juga artikel terkait disini:

Bagaimana cara Optimasi ELISA Kit?

Tips Memilih ELISA 96 Microwell Plate

IL-16, TNF-alpha, IL-1b dan 1L-8 ELISA Kit Merk Elabscience

Referensi:

Uji ELISA, Teknik ELISA http://repository.unimus.ac.id/

FAQs for ELISA, Elabscience

ELISA Sample Preparation Protocol, Finetest

ELISA sample preparation guide, Abcam