Panduan pengenceran antibodi, termasuk tehnik optimasi konsentrasi antibodi dan saran pengenceran.
Pengenceran yang digunakan
Rerata pengikatan antibodi dan konstanta afinitas antigen dapat dipengaruhi oleh suhu, ph dan konstituen bufer. Bervariasinya konsentrasi relatif antibodi dan antigen dapat juga mengontrol pembentukan komplek antibodi-antigen. Karena biasanya tidak mungkin untuk mengubah konsentrasi antigen, maka konsentrasi kerja optimal setiap antibodi individu harus ditentukan dengan pengenceran untuk setiap aplikasi dan disesuaikan dengan rangkaian kondisi percobaan.
Umumnya tiap vendor antibodi merekomendasikan pengenceran untuk masing-masing aplikasi yang tertera dalam datasheet. Namun, tetap saja dibutuhkan optimasi.
Optimasi pengenceran antibodi: percobaan titrasi
Konsentrasi optimal antibodi, yang bisa menghasilkan pewarnaan terbaik dengan background minimal, harus ditentukan dengan percobaan untuk tiap asay dan biasanya dengan menggunakan pengenceran berseri dalam percobaan titrasi. Sebagai contoh, jika pada datasheet disarankan menggunakan pengenceran 1:200, maka disarankan untuk membuat pengenceran 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 dan 1:500.
Percobaan titrasi dilakukan dengan terlebih dahulu memilih waktu inkubasi tetap dan kemudian dilanjutkan dengan percobaan pengenceran antibodi. Setiap pengenceran harus diuji pada jenis sampel yang sama untuk menjaga kondisi percobaan yang sama.
Umumnya antibodi akan memiliki konsistensi batch-to-batch yang sama, oleh karena itu dalam kebanyakan kasus hanya diperlukan satu percobaan titrasi. Namun, terutama untuk antibodi poliklonal, bila ada perubahan hasil pewarnaan di antara batch pada antibodi yang sama, sebaiknya lakukan percobaan titrasi lain.
Saran pengenceran untuk antibodi yang tidak ada rekomendasi pengenceran dalam datasheet
Persiapan antibodi unpurified berbeda secara signifikan dalam konsentrasi antibodi. Jika konsentrasi spesifik antibodi unpurified tidak diketahui, kami merekomendasikan untuk menggunakan kit pemurnian / pemurnian dan lihat tabel di bawah ini sebagai pedoman.
Tabel ini menyediakan berbagai pengenceran untuk digunakan pada setiap aplikasi dengan sumber antibodi berbeda:
| Supernatan Kultur Sel | Askit | Whole antiserum | Purified antibody | |
| WB/dot blot | 1/100 | 1/1000 | 1/500 | 1 µg/mL |
| IHC/ICC | Neat –1/10 | 1/100 | 1/50–1/100 | 5 µg/mL |
| EIA/ELISA | 1/1000 | 1/10000 | 1/500 | 0.1 µg/mL |
| FACS/Flow cytometry | 1/100 | 1/1000 | 1/500 | 1 µg/mL |
| IP | – | 1/100 | 1/50–1/100 | 1–10 µg/mL |
| Perkiraan konsentrasi IgG |