Artikel sebelumnya membahas tentang protein rekombinan secara pengertian, prinsip kerja dan komponen kunci yang dapat dipelajari pada link berikut. Selanjutnya, artikel ini akan membedah tuntas garis besar sistem ekspresi dari protein rekombinan. Yuk pelajari disini!

Sistem Ekspresi Protein Rekombinan

Istilah sistem ekspresi protein rekombinan adalah proses bioteknologi guna bulking protein target dalam jumlah banyak dengan menyisipkan gen spesifik pada mikroorganisme inang. Ketersediaan sumber daya biologis dan data urutan gen target yang mudah diakses, dikombinasikan dengan kemajuan dalam sistem produksi protein, telah memungkinkan banyak laboratorium untuk mulai memproduksi protein mereka sendiri untuk digunakan sebagai reagen biologis. Hal ini memungkinkan para peneliti untuk mengontrol biaya, ketersediaan, dan kualitas protein yang digunakan dalam eksperimen mereka. Berikut 4 sistem ekspresi utama untuk protein rekombinan:

Gambar 1. Alur pengambilan keputusan untuk sistem ekspresi protein.

Source: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10643540/

Gambar 2. Gambaran umum perbandingan karakteristik yang terkait dengan sistem ekspresi gen utama.

Source: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10643540/

A. Sistem Ekspresi Sel Prokariotik

Sistem Ekspresi Sel Prokariotik yang direpresentasikan oleh E. Coli, merupakan sistem paling awal dan paling ekonomis untuk memproduksi protein rekombinan. Sistem ini banyak digunakan dalam penelitian biologi molekuler dan bioteknologi, termasuk kloning gen, ekspresi protein, dan produksi, sebagai alat untuk mempelajari fungsi protein. E. Coli secara umum memproduksi protein yang mengandung ikatan disulfida karena E. Coli mendorong pembentukan ikatan disulfida sitoplasma atau protein tersebut disekresikan ke periplasma. Contoh protein rekombinan yang dapat diproduksi oleh sistem ekspresi E. Coli adalah jika protein target adalah protein yang terkait dengan membran atau protein membran integral (IMP). Keunggulan dari sistem ini adalah:

1. Pertumbuhan cepat: Escherichia coli dapat menyelesaikan pembelahan sel hanya dalam waktu 20 menit untuk mencapai reproduksi yang cepat.
2. Biaya rendah: E. Coli hanya membutuhkan media yang sederhana dan biayanya rendah.
3. Tingkat ekspresi tinggi: protein rekombinan tingkat tinggi dapat dihasilkan
4. Tidak memerlukan modifikasi kompleks: Tanpa modifikasi pasca-translasi yang kompleks, seperti glikosilasi, pelipatan ulang protein selanjutnya mungkin diperlukan.

B. Sistem Ekspresi Eukariotik Yeast

Yeast banyak digunakan sebagai inang untuk ekspresi protein rekombinan karena kombinasi karakteristiknya yang unik; memadukan kesederhanaan inang prokariotik uniseluler dengan mesin seluler kompleks yang khas dari eukariota. Saccharomyces cerevisiae dan Pichia pastoris (Komagataella spp.) adalah ragi yang paling umum digunakan untuk produksi protein heterolog. Ragi ini menawarkan keuntungan yang mirip dengan sistem bakteri, seperti pertumbuhan yang cepat, manipulasi genetik yang mudah, dan kebutuhan media yang hemat biaya. Ciri khas sistem ekspresi berbasis ragi dibandingkan dengan E. coli adalah kemampuannya untuk melakukan modifikasi pasca-translasi (PTM), seperti glikosilasi dan pembentukan ikatan disulfida. Kemampuan ini sangat penting untuk menghasilkan protein dengan struktur yang rumit atau yang membutuhkan PTM spesifik untuk fungsi yang tepat, seperti pada protein terapeutik.

Yeast mampu melakukan fermentasi dengan kepadatan tinggi dan memiliki mesin seluler yang diperlukan untuk melakukan modifikasi pasca-translasi tertentu seperti glikosilasi, pembentukan ikatan disulfida, dan pemrosesan proteolitik. Pada yeast, protein dapat diproduksi secara intraseluler, atau dapat disekresikan ke lingkungan ekstraseluler, yang membutuhkan keberadaan peptida sinyal N-terminal. Beberapa Yeast yang digunakan untuk ekspresi protein adalah Pichia pastoris (syn. Komagataella phaffii), Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, dan Kluyveromyces lactis.

Pada Yeast, protein dapat diproduksi secara intraseluler atau disekresikan ke lingkungan ekstraseluler; proses sekresi ini memerlukan keberadaan peptida sinyal N-terminal (misalnya, faktor α-mating atau Ost1). P. pastoris mampu melakukan glikosilasi yang terhubung melalui ikatan N maupun O. Glikosilasi pada yeast kaya akan struktur hipermanosil yang heterogen—berbeda dari struktur glikan mamalia yang lebih kompleks—sehingga berpotensi memicu antigenisitas. Oleh karena itu, berbagai upaya telah dilakukan untuk mengembangkan galur P. pastoris yang mampu melakukan glikosilasi-N yang terhumanisasi. Pichia pastoris juga menjadi inang penting di bidang ekspresi protein dan biofarmasi karena kemampuan pemanfaatan metanolnya yang unik dan kemampuan ekspresi gen eksogen yang efisien. Berikut adalah karakteristik dari yeast untuk ekspresi protein:

1. memiliki kemampuan untuk melakukan modifikasi pasca-translasi.
2. dapat mencapai tingkat ekspresi protein yang tinggi
3. dapat disekresikan ke dalam media kultur sehingga memudahkan pemurnian.
4. Cocok untuk protein yang memerlukan tingkat modifikasi pasca-translasi tertentu.
5. Keunggulan: tingkat ekspresi tinggi, dapat diinduksi, mekanisme glikosilasi menyerupai eukariota tingkat tinggi.
6. Limitasi: Beberapa produk protein mudah terdegradasi dan tingkat ekspresinya tidak dapat dikontrol.

C. Sistem Ekspresi Insect Baculovirus (ICES)

Sel serangga  merupakan inang serbaguna untuk mengekspresikan protein rekombinan, unggul dalam memproduksi protein intraseluler dan virus yang kompleks karena pelipatan proteinnya yang kuat dan kepadatan kultur yang tinggi. Protein dari sel serangga digunakan dalam penentuan struktur, desain obat, pengembangan uji, dan reagen diagnostik. Tidak seperti sistem bakteri, sel serangga menggunakan jalur sekresi dan pemrosesan protein yang mirip dengan mamalia, terutama melalui Golgi dan ER, memastikan pelipatan dan aktivitas yang benar untuk sebagian besar protein yang diproduksi. Selain itu, sel serangga mahir  dalam berbagai modifikasi pasca-translasi  (PTM) seperti fosforilasi, asetilasi, dan palmitoilasi. Pola glikosilasinya, yang lebih sederhana dan lebih seragam daripada sel mamalia.

Pada sel serangga, protein dapat diproduksi secara intraseluler, atau dapat disekresikan ke lingkungan ekstraseluler, yang membutuhkan keberadaan peptida sinyal N-terminal. Dalam banyak kasus, peptidase sel serangga dapat mengenali sekuens sinyal mamalia, tetapi dapat juga untuk menggunakan sekuens sinyal sel serangga asli (misalnya, gp67 , HBM , SP1, SP2 ). Galur sel serangga umum yang digunakan untuk produksi protein rekombinan meliputi sel Sf9, Hi-5, Sf21, dan S2, yang biasanya digunakan dalam sistem ekspresi berbasis plasmid atau yang dimediasi baculovirus. Dalam ekspresi berbasis plasmid, plasmid pembawa gen dimasukkan langsung ke dalam sel serangga, meskipun menghadapi keterbatasan karena pengenceran plasmid selama beberapa generasi berturut-turut.  Ekspresi yang dimediasi baculovirus , di sisi lain, memanfaatkan kemampuan alami baculovirus untuk menginfeksi dan bereplikasi di dalam sel serangga. Di sini, gen yang diinginkan diintegrasikan ke dalam genom baculovirus (bacmid), yang kemudian digunakan untuk menginfeksi sel inang seperti Sf9 atau Sf21, memfasilitasi replikasi virus dan produksi protein secara bersamaan.

Pendekatan ini menawarkan keuntungan signifikan untuk memproduksi protein dengan berat molekul tinggi dengan mengakomodasi sisipan DNA besar ke dalam genom baculovirus dan memungkinkan ekspresi bersama melalui sistem seperti MultiBac. Sel serangga yang digunakan dalam metode ini memastikan bahwa protein mengalami modifikasi pasca-translasi (PTM) penting, mencapai pelipatan yang tepat dan mempertahankan fungsi biologis. Berikut karakteristik untuk sistem ekspresi dengan sistem ICES:

1. memiliki kemampuan untuk melakukan modifikasi pasca-translasi sel eukariotik
2. ekspresi gen eksogen dapat mencapai 50% dari total protein sel serangga
3. Cocok untuk protein yang memerlukan glikosilasi kompleks dan modifikasi pasca-translasi lainnya.
4. Keunggulan: Protein memiliki fungsi biologis yang utuh, seperti pelipatan protein yang tepat dan pembentukan ikatan disulfida.
5. Keterbatasan: Ekspresi protein eksogen diatur oleh promotor virus tahap sangat lanjut (very late viral promoters) dan dapat disertai dengan kematian sel.

D. Sistem Ekspresi Sel Mamalia

Produksi protein dalam sel mamalia sangat cocok untuk protein eukariotik yang lebih besar atau lebih kompleks, karena dapat menawarkan lingkungan seluler yang sangat menyerupai lingkungan aslinya. Protein rekombinan dapat diproduksi sementara dalam sel mamalia dengan transfeksi menggunakan DNA plasmid atau dengan transduksi menggunakan baculovirus (BacMam). Metode yang paling banyak digunakan untuk TGE adalah transfeksi dengan DNA plasmid, karena cepat dan mudah diterapkan serta reagen transfeksi yang terjangkau seperti polietilenimina (PEI).

Terdapat dua strategi utama untuk mengekspresikan protein dalam sel mamalia: transfeksi transien dan transfeksi stabil. Dalam transfeksi transien, DNA yang mengkode protein yang diinginkan tetap sebagai elemen ekstrakromosomal dan cepat hilang selama replikasi sel. Sebaliknya, transfeksi stabil melibatkan integrasi DNA ke dalam genom sel, memastikan retensinya selama replikasi sel. Namun, membangun cell line yang ditransfeksi stabil merupakan proses yang memakan waktu, sumber daya, dan tenaga, membutuhkan waktu berminggu-minggu atau berbulan-bulan untuk mencapai produksi protein, sedangkan protein dari sel yang ditransfeksi transien dapat diperoleh dalam waktu 3-7 hari . Oleh karena itu, transfeksi transien lebih umum digunakan dalam penelitian dan uji klinis tahap awal di mana produksi protein cepat dalam jumlah miligram hingga gram sangat penting. Untuk aplikasi yang membutuhkan ekspresi protein yang berkelanjutan, bervolume tinggi, dan dapat diprediksi—seperti produksi antibodi monoklonal untuk terapi— transfeksi stabil lebih disukai.

Garis sel mamalia yang paling sering digunakan untuk produksi protein rekombinan meliputi sel ovarium hamster (CHO) dan sel ginjal embrionik manusia 293 (HEK-293). Industri biofarmasi sebagian besar bergantung pada sel CHO karena hasil proteinnya yang tinggi, genetika yang terkarakterisasi dengan baik, skalabilitas dalam kultur suspensi, dan kemampuan untuk melakukan glikosilasi kompleks yang penting untuk fungsi protein terapeutik. Namun, kultur sel CHO mahal, pola glikosilasinya mungkin berbeda dari sel manusia, dan pengembangan garis sel yang stabil memakan waktu. Sel HEK-293 populer di lingkungan penelitian untuk memproduksi protein rekombinan, terutama yang membutuhkan modifikasi pasca-translasi seperti manusia. Sel HEK-293 sangat mudah ditransfeksi, berproliferasi dengan cepat, dan melakukan modifikasi seperti manusia, sehingga cocok untuk ekspresi protein sementara. Di sisi lain, sel HEK-293 sering menghasilkan kuantitas yang lebih rendah daripada sel CHO, menghadapi masalah stabilitas dengan ekspresi sementara, dan menghadapi tantangan dalam peningkatan skala untuk produksi industri. Varian terbaru seperti HEK293F dan Expi293F yang diadaptasi untuk kultur suspensi bertujuan untuk menyederhanakan peningkatan skala produksi protein.

Produksi protein rekombinan menggunakan sistem ekspresi mamalia menghadirkan beberapa tantangan signifikan. Pertama, sistem ini memerlukan biaya lebih tinggi dibandingkan dengan E. coli atau ragi karena media khusus, kondisi kultur, dan jangka waktu produksi yang lebih lama. Kedua, pengembangan lini sel mamalia yang stabil untuk ekspresi protein membutuhkan banyak tenaga dan waktu, melibatkan seleksi klon berdasarkan karakterisasi menyeluruh dari profil ekspresi protein, karakteristik pertumbuhan, dan stabilitas genetik untuk memastikan kesesuaian untuk produksi skala besar. Selanjutnya, meskipun sel mamalia unggul dalam modifikasi pasca-translasi yang kompleks seperti glikosilasi, mencapai PTM yang konsisten dapat menjadi sulit, yang menyebabkan produk protein heterogen. Selain itu, sel mamalia biasanya menghasilkan jumlah protein rekombinan yang lebih rendah dibandingkan dengan sistem mikroba. Peningkatan skala produksi kultur sel mamalia dengan bioreaktor yang lebih besar dan infrastruktur yang lebih baik dimungkinkan, tetapi dapat meningkatkan biaya operasional lebih lanjut bagi pengembang.

Berikut karakteristik sistem ekspresi sel mamalia:

1. Mampu melakukan modifikasi pasca-translasi yang kompleks, seperti glikosilasi.
2. Tingkat ekspresi berkisar dari rendah hingga sedang, bergantung pada lini sel dan vektor yang dipilih.
3. Biaya relatif tinggi; persyaratan teknis operasional juga tinggi.
4. Cocok untuk ekspresi protein yang memerlukan modifikasi pasca-translasi yang ketat, seperti protein terapeutik tertentu.
5. Keunggulan: Protein rekombinan yang diekspresikan memiliki konformasi yang menyerupai protein manusia, sehingga cocok untuk mempelajari fungsi protein-protein spesifik tertentu.
6. Keterbatasan: Tingkat ekspresi relatif rendah, biaya tinggi, dan terkadang dapat menyebabkan infeksi virus.

Pemilihan sistem bergantung pada karakteristik protein target, hasil dan kualitas protein yang diinginkan, serta kebutuhan spesifik eksperimen. Sebagai contoh, untuk protein dengan struktur sederhana yang tidak memerlukan modifikasi kompleks, sistem ekspresi prokariotik bisa menjadi pilihan yang hemat biaya. Untuk protein yang memerlukan modifikasi spesifik, sistem ekspresi ragi atau sel mamalia lebih sesuai. Sistem ekspresi sel serangga cocok untuk protein yang memerlukan modifikasi pasca-translasi kompleks dalam lingkungan sel eukariotik.

Berikut beberapa contoh produk antibodi yang diekspresikan dengan beberapa sistem ekspresi protein seperti diatas dari brand Elabscience:

Berikut merupakan contoh daftar produk protein rekombinan yang dapat kami supply. Untuk informasi selanjutnya dan diskusi dapat menghubungi pada kontak berikut.

Source:

https://futurefields.io/overview-of-recombinant-protein-expression-systems/?srsltid=AfmBOoo4phgrMtyQqgUolAtlYWc5PX4A8PFca8saa57X7bfLGUAWHx8-

https://www.biosynsis.com/blog/overviewof-the-four-major-protein-expression-systems/

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10643540/