A. Mengenal MSCs dan Eksosom

MSC (Mesenchymal Stem Cells) adalah sel stroma multipoten non-hematopoietik yang memiliki kemampuan untuk memperbarui diri dan juga menunjukkan diferensiasi multilineage. Kemampuan berdiferensiasi ini termasuk garis keturunan mesodermal (osteoblas, kondrosit, adiposit), serta garis keturunan ektodermal dan endodermal. MSC dapat diisolasi dari berbagai jaringan, seperti tali pusat, polip endometrium, darah menstruasi, sumsum tulang, jaringan adiposa, dan lain-lain. Hal ini karena kemudahan pengambilan dan jumlah yang diperoleh menjadikan sumber-sumber tersebut paling praktis untuk aplikasi eksperimental bahkan aplikasi klinis.

Menurut International Society for Cellular Therapy (ISCT), MSC didefinisikan berdasarkan tiga kriteria utama:

1. Kemampuan menempel pada permukaan plastik saat dikultur dalam kondisi standar.
2. Ekspresi penanda khusus pada permukaan (seperti CD73, CD90, dan CD105; ≥95%) tanpa adanya ekspresi penanda hematopoietik (CD34, CD45, CD14 atau CD11b, CD79α atau CD19, HLA-DR; ≤2%).
3. Kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi garis keturunan osteogenik, kondrogenik, dan adipogenik dalam kondisi in vitro.

Gambar 1. Mesenchymal Stem Cells

MSC dapat diklasifikasikan ke dalam berbagai jenis berdasarkan jaringan asalnya, sebagai berikut.

1. MSC yang berasal dari sumsum tulang (BM-MSC) merupakan jenis yang paling banyak diteliti dan dikenal karena potensi diferensiasi yang tinggi serta efek imunomodulator yang kuat.
2. MSC yang berasal dari jaringan adiposa (AD-MSC) lebih mudah dipanen dan diisolasi dibandingkan dengan BM-MSC, dengan sifat terapeutik yang sebanding.
3. MSC yang berasal dari tali pusat (UC-MSC) dikenal karena proliferasinya yang lebih baik dan imunogenisitas yang lebih rendah, sehingga cocok untuk transplantasi alogenik.
4. Sel punca pulpa gigi (DP-SC) dan MSC yang berasal dari plasenta (P-MSC) merupakan sumber yang sedang berkembang dengan sifat regeneratif unik serta aplikasi spesifik dalam kedokteran gigi dan kebidanan.

Gambar 2. Exosome

Eksosom adalah vesikel kecil berbentuk bulat dengan diameter berkisar antara 30 dan 120 nm yang dihasilkan oleh semua jenis sel hidup. Eksosom terbentuk melalui proses pembentukan tonjolan ke dalam pada endosom akhir, yang mengakibatkan terbentuknya vesikel intraluminal (ILV) di membran awal badan multivesikular (MVB). Eksosom-eksosom ini kemudian dilepaskan saat membran pembatas MVB menyatu dengan membran sel.

Eksosom dapat ditransfer dari sel inang ke sel tujuan, yang mengakibatkan transfer informasi epigenetik dan pemrograman ulang aktivitas seluler sel penerima. Eksosom mengangkut berbagai molekul muatan, termasuk metabolit, fragmen DNA, messenger RNAs (mRNAs), noncoding long RNAs (lncRNAs) and microRNAs (miRNAs), protein, serta lipid, dari sel asalnya ke sel target. Eksosom baru-baru ini mendapat banyak perhatian sebagai mediator komunikasi antar sel dalam kondisi fisiologis yang sehat serta di bawah tekanan patofisiologis. Eksosom memainkan peran penting dalam banyak proses yang berkontribusi pada perkembangan kanker, termasuk pemeliharaan metastasis kanker, munculnya resistensi terhadap pengobatan, respons inflamasi, dan regulasi imunologi. Eksosom kini digunakan dalam lebih dari 400 uji klinis untuk berbagai gangguan, baik sebagai mediator terapeutik langsung maupun sebagai biomarker untuk respons terapi.

B. Isolasi dan Kultur MSC

MSC telah diisolasi dari berbagai jaringan dewasa dan perinatal, terutama jaringan adiposa, sumsum tulang, dan tali pusat, tetapi juga dari pulpa gigi, darah menstruasi, cairan amnion, atau sumber lainnya. Terlepas dari asal-usulnya, semua MSC ini dapat memenuhi kriteria minimal dari ISCT dalam hal fenotipe, diferensiasi, dan kemampuan imunoregulatori.  Sumber MSC yang paling umum yang dievaluasi dalam uji klinis adalah tali pusat, sumsum tulang, dan jaringan adiposa, dan meskipun MSC yang diisolasi dari sumber lain juga telah digunakan, pengalaman terkait sumber-sumber tersebut masih terbatas.

Gambar 3. Isolation MSC dari Tali Pusat dan Plasenta

1. Pengambilan Sampel dan Isolasi BM-MSC

1. Sumsum tulang diambil pada kretus iliaka sebagai lokasi pilihan untuk memperoleh volume sumsum tulang yang lebih besar untuk aplikasi klinis.
2. Dilakukan beberapa tusukan dan aspirasi sumsum tulang dalam volume kecil 1–4 ml menggunakan jarum suntik 10 ml yang telah terisi heparin, atau melalui beberapa atau satu titik aspirasi sumsum tulang dalam volume besar dengan pengalihan arah jarum.
3. Sampel sumsum tulang disimpan pada suhu 2–8°C jika diperlukan penyimpanan semalam atau pengiriman. Sumsum tulang harus diproses dalam waktu 24 jam setelah pengambilan, meskipun beberapa penelitian menunjukkan bahwa MSC yang berasal dari sumsum tulang yang di kriopreservasi memiliki kinetika pertumbuhan yang sama dan memenuhi kriteria ISCT.
4. Aspirasi BM dapat langsung dikultur, tetapi lebih sering melalui proses sentrifugasi gradien kepadatan untuk mengisolasi sel berinti sumsum tulang (BM-NC).
5. Setelah diperoleh, BM-NC harus ditanam dengan kepadatan penanaman rendah, sekitar 1–2 × 10⁵ sel/cm² untuk meningkatkan proliferasi populasi sel yang melekat pada tahap P0.

Dalam beberapa tahun terakhir, baik jaringan tali pusat maupun jaringan lemak telah lebih banyak digunakan daripada sumsum tulang (BM) sebagai sumber MSC karena beberapa keunggulan logistik dan fungsional. UC-MSC memiliki potensi proliferasi dan diferensiasi yang lebih tinggi daripada MSC yang diperoleh dari jaringan dewasa serta mengekspresikan penanda pluripotensi yang tidak ditemukan pada sel dewasa. Berikut merupakan langkah pengambilan sampel dan isolasi UC-MSC.

2. Pengambilan Sampel dan Isolasi UC-MSC

1. Sampel tali pusat dapat disimpan pada suhu 2–8°C
2. MSC dapat diisolasi melalui metode eksplan atau pencernaan enzimatik
3. Pada metode eksplan, setelah arteri dan vena dibuang, jaringan yang tersisa beserta jelly Wharton dipotong menjadi fragmen-fragmen kecil dan disuspensikan dalam media kultur selama 7 hari di dalam inkubator berhumiditas pada suhu 37°C dengan konsentrasi CO₂ 5%.
4. Jaringan tersebut harus dibiarkan tanpa gangguan agar sel-sel dapat bermigrasi dari eksplan, sementara media kultur harus diganti secara berkala.
5. Untuk pencernaan enzimatik, tali pusat dipotong menjadi fragmen-fragmen kecil dan diinkubasi dengan 500 U/mL kolagenase pada suhu 37°C dalam alat disosiasi jaringan. Selanjutnya, sel-sel yang diperoleh ditanam dalam culture flask.

3. Pengambilan Sampel dan Isolasi ADSC

1. Jaringan lemak subkutan dapat dengan mudah diperoleh dari donor melalui reseksi in bloc atau dengan kanula yang terhubung ke sistem hisap.
2. Pengambilan lemak melalui liposuction merupakan teknik pengambilan yang lebih umum digunakan untuk donor yang sehat dan dapat dikombinasikan dengan energi ultrasonik untuk memecah jaringan lemak guna memudahkan pengangkatannya serta mengurangi perdarahan dan waktu operasi.
3. Lipoaspirate disimpan tidak lebih dari 24 jam pada suhu 2–8°C untuk menjaga kualitas optimal sel punca jaringan lemak (ADSCs).
4. Pencernaan enzimatik dengan kolagenase rekombinan berstandar GMP, dilanjutkan dengan sentrifugasi dan pencucian, merupakan metode
5. Isolasi yang paling umum digunakan untuk jaringan adiposa.
6. Konsentrasi enzim liofilisasi berkisar antara 0,075% (b/v) hingga 0,3% (b/v).
7. Selanjutnya tahap lisis eritrosit untuk menghilangkan kontaminasi eritrosit.

4. Ekspansi MSC

Perlu dipastikan, MSC harus telah melekat pada permukaan kultur dan berkembang biak, tetapi tidak boleh mencapai lebih dari 80% konfluensi untuk mencegah penghambatan akibat kontak antar sel. Bioreaktor memungkinkan pemberian nutrisi secara berkala pada kultur, menjaga tingkat metabolit yang penting untuk ekspansi sel tetap terkendali, serta memungkinkan ekspansi MSC yang lebih cepat dan lebih sehat dibandingkan kultur konvensional.

Konsentrasi oksigen juga merupakan parameter penting yang perlu dikendalikan. Dalam beberapa tahun terakhir, hipoksia (3–5%) diklaim sebagai lingkungan yang lebih fisiologis bagi sel dibandingkan normoksia (21%). Namun, hingga saat ini, MSC sebagian besar dikultur dalam kondisi normosik dan alasan yang mendasari perubahan tersebut memerlukan validasi. Alpha-minimum essential medium (a-MEM) atau Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) yang ditambahkan dengan serum sapi janin (FBS) merupakan media kultur standar emas untuk MSC yang digunakan dalam sebagian besar uji klinis. Namun, FBS xenogenik memiliki beberapa kelemahan imunologis dan masalah infeksi yang memerlukan pengendalian dan validasi pada setiap batch. Oleh karena itu, terdapat minat dalam pengembangan pengganti serum dan media bebas serum untuk ekspansi skala besar sambil tetap menjaga karakteristik MSC. Kultur UC-MSC yang diberi 7,5%–10% plasma kaya trombosit yang diaktifkan, yang diperoleh dari darah tali pusat donor, menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan yang dikultur dengan media standar yang mengandung FBS. Selain itu, ADSC telah berhasil dikultur dengan lisat trombosit alogenik yang dihasilkan melalui proses pembekuan-pencairan konsentrat trombosit manusia. Namun, karena penggunaan hPL juga menimbulkan masalah ekonomi dan regulasi, upaya di masa depan ditujukan untuk mengembangkan formulasi standar berstandar GMP dengan molekul bioaktif rekombinan guna “mengkompensasi” berkurangnya atau tidak adanya serum.

C. Metode Isolasi Eksosom

MSC yang telah berhasil diisolasi dan dikultur selanjutnya dapat digunakan sebagai sumber eksosom. Berikut merupakan langkah isolasi eksosom.

1. MSC diinkubasi pada suhu 37°C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan konsentrasi CO₂ 5%.
2. Sel-sel yang melekat dibiarkan berkembang hingga mencapai kepadatan (konfluensi) sekitar 80%.
3. Morfologi sel MSC yang telah diisolasi dan dikembangkan dan dievaluasi selama periode kultur sel menggunakan mikroskop cahaya dan analisis FACS.
4. Untuk produksi dan pemanenan eksosom, sel-sel dibudidayakan dalam medium tanpa nutrisi hingga 72 jam (kondisi tanpa nutrisi, < 2% hPL bebas eksosom). Setelah masa tanpa nutrisi, supernatan sel dikumpulkan dan eksosom diisolasi menggunakan Exosome Isolation Kit.
5. Isolasi eksosom dari supernatant MSC dimulai dengan pemurnian eksosom positif CD9 dan CD81 dari supernatant kultur sel MSC dilakukan menggunakan Kit Isolasi Eksosom masing-masing sesuai dengan petunjuk yang disertakan.
6. Secara singkat, supernatant kultur sel MSC disentrifugasi pada 3000 x g selama 10 menit.
7. Supernatant disaring melalui filter polieter-sulfona berukuran 0,2 µm.
8. Buffer elusi dan PBS disaring melalui filter selulosa asetat (0,2 μm).
9. Setelah buffer penyimpanan dikosongkan, kolom diisi dengan Fab-Streps.
10. Media kultur yang telah disaring dipindahkan ke kolom secara bertahap sebanyak 1 ml setiap kali.
11. Setelah pencucian, Buffer Elusi Biotin yang telah disaring diaplikasikan ke matriks untuk mengumpulkan eksosom. Ukuran eksosom dianalisis dengan instrumen NanoSight LM10 (Malvern Instruments) dan data diproses menggunakan perangkat lunak NTA versi 2.3.
12. Kandungan protein ditentukan dengan Western Blot menggunakan antibodi deteksi monoklonal untuk Alix dan CD63.

D. Produk dan Reagen Pendukung Riset

INDOGEN dapat membantu menyuplai reagen yang Anda butuhkan untuk riset maupun klinis terkait MSC dan eksosom dari brand Procell Systems. Procell Systems merupakan manufaktur reagen terpercaya yang menyediakan berbagai macam kebutuhan kultur sel. Berikut merupakan daftar produk Procell Systems yang digunakan untuk MSC dan eksosom.

Tabel 1. Daftar Produk Procell Systems yang Digunakan untuk MSC dan Eksosom.

Untuk pertanyaan produk dan stock lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kontak yang tertera pada laman website Indogen berikut. Terima kasih.

Sumber:

1. Mesenchymal Stem Cells
2. Mesenchymal stem cells in treating human diseases: molecular mechanisms and clinical studies
3. A comprehensive review on recent advances in exosome isolation and characterization: Toward clinical applications
4. From bench to bedside: translating mesenchymal stem cell therapies through preclinical and clinical evidence
5. What are exosomes?
6. Optimization of Mesenchymal Stromal Cell (MSC) Manufacturing Processes for a Better Therapeutic Outcome
7. An efficient protocol to generate placental chorionic plate-derived mesenchymal stem cells with superior proliferative and immunomodulatory properties
8. ISOLATION OF EXOSOMES FROM MESENCHYMAL STEM CELLS

Artikel Terkait:

1. Membedah MSC Dewasa: Karakter, Diferensiasi, dan BPOM Indonesia
2. Webinar-Workshop Cell Culture: “The Significance of Employing Reduced and Serum-Free Media for Stem Cells and Stable Cell Lines in Research”
3. Bagaimana Cara Mengisolasi Mesenchymal Stem Cell (MSC) dengan Flow Cytometry
4. WEBINAR-WORKSHOP SEL PUNCA DAN EKSOSOM
5. WORKSHOP: “BASIC TO ADVANCED PRACTICAL TRAINING IN MSCs CULTURE AND EXOSOME CHARACTERIZATION”
6. Riset Stem Cell: Model Penyakit dan Aplikasi Klinis